생체 내 2 광자 형광 평생 이미징 현미경 을 사용하여 머리 고정 행동 마우스에서 단백질 키나제 활동을 시각화
Summary
절차는 머리 고정, 행동 마우스에서 단백질 키나제 A 활동을 시각화하기 위해 제시된다. 향상된 A-키나아제 활동 리포터, tAKARα는 피질 뉴런으로 표현되고 두개골 창을 통해 이미징에 접근할 수 있게 된다. 2 광자 형광 일생 화상 진찰 현미경 검사법은 강제운동 도중 생체 내 PKA 활동을 구상하기 위하여 이용됩니다.
Abstract
신경 변조는 뇌 기능에 대한 강력한 제어를 발휘합니다. 신경 조절 시스템의 기능 장애는 신경 및 정신 장애에 결과. 그들의 중요성에도 불구 하 고, 세포 해상도 신경 변조 이벤트를 추적 하기 위한 기술은 등장 하기 시작. 도파민, 노르에피네프린, 아세틸콜린 및 세로토닌과 같은 신경 조절제는 각각의 G 단백질 결합 수용체를 통해 세포내 신호 전달 이벤트를 트리거하여 신경 흥분성, 시냅스 통신 및 기타 뉴런을 조절합니다. 신경 네트워크에서 정보 처리를 조절할 수 있습니다. 위에서 언급 한 신경 조절제는 cAMP / 단백질 키나아제 A (PKA) 통로에 수렴합니다. 따라서, 단일 세포 해상도를 가진 생체 내 PKA 이미징은 신경 전기 활동을 위한 칼슘 이미징과 유사한 방식으로 신경 조절 이벤트에 대한 판독으로 개발되었다. 본 명세서에서, 헤드 고정 행동 마우스의 피질에서 개별 뉴런의 수준에서 PKA 활성을 시각화하는 방법이 제시된다. 이를 위해, 개선 된 A-키나아제 활동 리포터 (AKAR), 라는 tAKARα, Förster 공명 에너지 전송 (FRET)를 기반으로 사용 됩니다. 이 유전자 부호화 된 PKA 센서는 DNA 플라스미드의 자궁 전기 천공 (IUE) 또는 아데노 관련 바이러스 (AAV)의 입체 적 주입을 통해 모터 피질에 도입됩니다. FRET 변화는 광산성 뇌 조직에서 FRET 신호를 정량화하기 위한 비율 메트릭 FRET 측정에 비해 이점을 제공하는 2광자 형광 평생 이미징 현미경(2pFLIM)을 사용하여 이미지화됩니다. 강제 운동 중 PKA 활동을 연구하기 위해 tAKARα는 속도 제어 전동 러닝 머신에서 실행하거나 쉬는 깨어있는 머리 고정 마우스의 피질 위의 만성 두개골 창을 통해 이미지화됩니다. 이 화상 진찰 접근은 생체 내 화상 진찰을 위한 그밖 FLIM 기지를 둔 센서에 대응하는 행동 유도한 PKA 활동을 공부하기 위하여 많은 그밖 두뇌 지구에 적용될 것입니다.
Introduction
또한 느린 시냅스 전송으로 알려진 신경 변조는 스트레스, 각성, 주의 및 운동과 같은 다른 행동 상태동안 뇌 기능에 대한 강력한 제어를 부과 1,2,3, 4. 그 중요성에도 불구하고, 신경 조절 이벤트가 일어나는 시기와 장소에 대한 연구는 아직 초기 단계에 있습니다. 아세틸콜린, 도파민, 노르아드레날린, 세로토닌 및 많은 뉴로펩타이드를 포함한 신경 조절제는 G 단백질 결합 수용체(GPCRs)를 활성화하여 광범위한 기간의 확장창을 통해 세포내 두 번째 메신저 경로를 트리거합니다. 초에서 시간까지. 각 신경 조절기는 신호 이벤트의 뚜렷한 세트를 트리거하는 동안, cAMP /단백질 키나제 A (PKA) 통로는많은 신경 조절제 1,5에대한 일반적인 다운스트림 통로입니다. cAMP/PKA 통로는 신경 흥분성, 시냅스 전송 및 가소성 6,7,8,9,따라서, 신경 네트워크 역학을 조정합니다. 다른 뉴런 또는 뉴런 유형이 신경 조절제 수용체의 다른 유형 또는 수준을 표현하기 때문에10,동일한 세포 외 신경 조절기의 세포 내 효과는 다른 뉴런에 걸쳐 이질적 일 수 있으며, 따라서, 세포 해상도로 공부했습니다. 날짜를, 그것은 행동 하는 동안 생체 내 개별 뉴런에서 신경 조절 이벤트를 모니터링 하는 도전 남아.
신경 변조의 시공간 역학을 연구하기 위해서는 적절한 기록 양식이 필요합니다. 미세 투석 및 빠른 스캔 주기적 voltammetry는 신경 조절제의 방출을 연구하는 데 자주 사용되지만 세포 이벤트를 모니터링하는 공간 해상도가 부족합니다11,12. 집단 화상 진찰13에 있는 신경 전기 활동에 대한프록시로 이용되고 있는 칼슘 역학과 유사하게, PKA 화상 진찰은 세포 해결책에 신경 인구에 걸쳐 신경 조절 사건을 판독하기 위하여 이용될 수 있습니다. 본 프로토콜은 동물 행동 동안 생체 내에서 PKA 활동을 모니터링하기 위해 개선된 A-키나아제 활성 리포터(AKAR)의 사용을 설명한다. 여기에 설명된 방법은 생리학적 신경 조절 이벤트를 추적하는 시간적 해상도로 세포 내 해상도에서 신경 인구의 동시 이미징을 허용합니다.
AR은 PKA 인산화 기질 펩타이드 및 기질의 인산화 세린 또는 스레오닌에 결합하는 지게차 관련(FHA) 도메인에 의해 연결된 공여자 및 수용체 형광 단백질(14,15)으로구성된다. PKA 통로의 활성화시, AKAR의 기질 펩티드는 인산화된다. 그 결과, FHA 도메인은 인산화된 기질 펩티드에 결합하여, 두 개의 형광단을 근접하게, 즉 AKAR의 폐쇄 상태라고 한다. 인산화된 AKAR의 폐쇄 상태는 기증자와 수용자 형광단 사이의 증가된 Förster 공명 에너지 전달(FRET)을 초래합니다. 인산화된 AR의 비율은 PKA 활성도 16의수준과 관련이 있기 때문에, 생물학적 샘플내의 FRET양은 PKA 활성의 수준을 정량화하는데 사용될 수 있다16,17,18, 19,20.
AR의 초기 버전은 주로 2색 비율 측정 이미징14를위해 설계되었습니다. 뇌 조직에 더 깊은 이미징을 할 때, 비율 측정 방법은 파장 의존광 산란으로 인해 신호 왜곡을 겪습니다17,18,21. 아래에 논의된 바와 같이, 형광 평생 화상 진찰 현미경 검사법 (FLIM)은 FLIM이 기증자 형광에 의해 방출된 광자만 측정하기 때문에 이 문제를 제거합니다18,21. 그 결과, FRET의 FLIM 정량화는 조직 심도(17)에 의해 영향을 받지 않는다. 또한, 수용기 형광단의 “다크”(즉, 낮은 양자 수율[QY]) 변이체가 사용될 수 있다. 이는 제2 센서 또는 형태학적마커(17,19,20)의동시 이미징을 통해 직교 뉴런 특성의 다중화 측정을 용이하게 하는 컬러 채널을 해제한다.
FLIM 이미징은 형광공이 흥분한 상태, 즉 형광 수명18에서보내는 시간을 정량화합니다. 불소가 지면 상태로 돌아오면, 따라서 흥분 상태의 끝은 종종 광자의 방출과 수반된다. 개별 흥분 분자에 대한 광자의 방출은 스토크이지만, 집단에서 평균 형광 수명은 특정 형광공의 특징입니다. 형광단의 순수한 인구가 동시에 흥분되면, 생성된 형광은 하나의 기하급수적 붕괴를 따를 것이다. 이 지수 붕괴의 시간 상수는 형광 단백질의 경우 일반적으로 1 ~ 4 나노 초 범위 평균 형광 수명에 해당합니다. 흥분한 공여자 형광단의 지상 상태로의 복귀는 또한 FRET에 의해 발생할 수 있다. FRET의 존재에서, 기증자 형광의 형광 수명이 감소된다. 인산화되지 않은 ALA는 상대적으로 더 긴 공여자 형광 수명을 나타낸다. PKA에 의한 인산화 시, 센서는 기증자와 수용자 형광체가 서로 가까이 가져오고 FRET가 증가하기 때문에 수명이 짧아지게 됩니다. 따라서 ALA의 집단에서형광 수명의 정량화는 PKA 활성의 수준을 나타낸다.
ALA의 초기 버전은 단세포 해상도에서 생체 내 이미징에 성공적으로 사용되지 않았습니다. 이는 주로 생리적 활성화(17)에 대한 AKAR 센서의낮은 신호 진폭 에 기인한다. 최근에는 2광자 형광 평생 이미징 현미경 검사법(2pFLIM)에 사용할 수 있는 AKAR 센서를 체계적으로 비교하여 FLIM-AKAR라는 센서가 대체 센서를 능가하는 것으로 나타났습니다. 더욱이, 표적으로 한 AKAR (tAKARs)에게 불린 일련의 FLIM-AKAR 이체는 특정 세포소 위치에서 PKA 활동을 구상하기 위하여 개발되었습니다: 마이크로소튜블 (tAKARα), 시토졸 (tAKARβ), 액틴 (tAKARδ), 필라멘트 액틴 (tAKARθ), 막 (tAKARγ), 및 후성 밀도 (tAKARθ). tAKAR중, tAKARα는 노르에피네프린에 의해 유도된 신호 진폭을 2.7배 증가시였다. 이는 뉴런에서 PKA의 대다수가 휴식 상태22,23에서미세소관에 고정된다는 지식과 일치한다. tAKARα는 2pFLIM에 대한 기존 AR 중 최고의 성과를 보였습니다. 더욱이, tAKARα는 다중 신경조절기에 의해 유도된 생리학적 관련 PKA 활성을 검출하고, tAKARα의 발현은 신경 기능17을변화시키지 않았다.
최근, tAKARα는 헤드 고정 된 행동 마우스(17)에서PKA 활동을 시각화하는 데 성공적으로 사용되었다. 운동운동이 운동, 배럴 및 시각 코르티케에서 피상층 뉴런(층 1~3, 피아로부터 ~300 μm의 깊이까지)의 소마에서 PKA 활성을 유발한 것으로 나타났다. 운동 트리거된 PKA 활동은 β-아드레날린 수용체 및 D1 도파민 수용체를 통한 신호화에 부분적으로 의존했지만, D2 도파민 수용체 길항제에 의해 영향을 받지 않았다. 이 작품은 2pFLIM을 사용하여 생체 내에서 신경 변조 이벤트를 추적하는 tAKARs의 능력을 보여줍니다.
현재 프로토콜에서, 시행된 운동 패러다임 동안 헤드 고정 깨어 있는 마우스에서 PKA 활성 이미징을 위한 전체 방법은 6단계로 설명된다. 먼저, 종래의 2광자 현미경에 2pFLIM 기능을첨가하였다(도 1). 둘째, 전동 러닝머신의 시공(도 2). 셋째, DNA 플라스미드의 자궁 전기천공화(IUE)에 의해 마우스 피질에서 tAKARα 센서의 발현, 또는 아데노 관련 바이러스(AAV)의 입체주입. IUE24,25 및 바이러스 성 입자(26)의 입체 주입에 대한 수술을위한 우수한 프로토콜은 이전에 출판되었다. 우리가 사용하는 주요 매개 변수는 아래에 설명되어 있습니다. 앞으로, 두개골 창의 설치. 우수한 프로토콜은 이전에 두개골 창 수술에대한 출판된 27,28. 표준 프로토콜에서 수정된 몇 가지 단계가 설명되어 있습니다. 다섯째, 생체 내 2pFLIM에서 수행. 여섯째, 2pFLIM 이미지의 분석(도3 및 도4). 이 접근법은 다른 많은 머리 고정 행동 패러다임 및 뇌 영역에 쉽게 적용 되어야 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 FRET-FLIM 센서 tAKARα를 사용하여 머리 고정 된 행동 마우스에서 신경 변조 트리거 PKA 활성을 시각화하는 것을 보여줍니다. 본 출원은 얻어진 FLIM 신호가 생리학적 신경조절 이벤트(17)와 관련이 있음을 입증하기 위해 시험관내 및생체내 tAKARα의 광범위한 시험 및 특성화에 기초한다. 여기서, 하나의 생체 내 응용 프로그램, 운동 유도 PKA 활성 모터 피질에서, 뇌에 센서…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
테스 J. 라마이어, 루스 프랭크, 마이클 A. 무니악 박사와 맥스 플랑크 플로리다의 야스다 료헤이 박사에게 2pFLIM 인수 소프트웨어에 감사드립니다. 이 작품은 두 개의 브레인 이니셔티브 어워드 U01NS094247 (H.Z. 및 T.M.) 및 R01NS104944 (H.Z. 및 T.M.), R01 교부금 R01NS081071 (T.M.), R21 교부금 R21NS097856 (H.Z)에 의해 지원되었습니다. 모든 상은 미국 국립 신경 장애 및 뇌졸중 연구소에서.
Materials
| 0.2 μm cellulose acetate syringe filter | Nalgene | 190-2520 | Step 3.2.2. |
| 16x 0.8 NA water-immersion objective | Nikon | MRP07220 | Step 5.5. |
| 3-pin cable | US digital | CA-MIC3-SH-NC | Step 2.5. To connect rotation sensor to the DAQ input of the microscope |
| Aluminum bread board | Thorlabs | MB1012 | Step 2.5. |
| AnimalTracker MATLAB software | N/A | N/A | Step 2.5 and sections 5 – 6. Will be provided upon request to the lead author |
| Band-pass barrier filter | Chroma | ET500-40m | Step 1.4. |
| Cage plate | Thorlabs | CP01 | Step 2.4. Used as mount for rotation sensor |
| Carbon steel burrs for micro drill, 0.5 mm tip diameter | FST | 19007-05 | Steps 3.2.3. and 4.4. |
| Circular coverslip (5mm diameter) | VWR | 101413-528 | Step 4.5. |
| Custom-made injection needle holder | N/A | N/A | Step 3.2.4. Technical details provided upon request to the lead author |
| Dental acrylic | Yates Motloid | 44114 | Steps 4.3. and 4.5. |
| Dental drill; Microtorque ii | Ram products | 66699 | Steps 3.2.3. and 4.4. |
| Dowsil transparent polymer | The Dow Chemical Company | 3-4680 | Step 4.5. Artificial dura |
| Electroporation electrode | Bex | LF650P5 | Step 3.1.4. |
| Electroporator | Bex | CUY21 | Step 3.1.4. |
| Fast green FCF | Sigma-aldrich | F7258-25G | Step 3.1.1. |
| FLIMimage MATLAB software | N/A | N/A | Section 5. Kindly provided by Dr. Ryohei Yasuda, Max Planck Florida |
| FLIMview MATLAB software | N/A | N/A | Sections 5. and 6. Will be provided upon request to the lead author |
| Foam-compatible glue (Gorilla White Glue) | Gorilla | 5201204 | Step 2.3. |
| Headplate | N/A | N/A | Step 4.3. Technical details provided upon request to the lead author |
| Headplate holder | N/A | N/A | Step 2.6. Technical details provided upon request lead author, used in combination with mounting post bracket and right-angled bracket |
| Hydraulic micromanipulator | Narishige | MO-10 | Step 3.2.4. |
| Krazy glue | Krazy glue | KG82648R | Step 4.3. Cyanoacrylate-based glue |
| Low-noise fast photomultiplier tube | Hamamatsu | H7422PA-40 or H10769PA-40 | Step 1.3. |
| MATLAB 2012b | Mathworks | N/A | Steps 2.6, and sections 5, and 6. Used to run microscope acquisition and data analysis software |
| Motor | Zhengke | ZGA37RG | Step 2.4. |
| Motor speed controller | Elenker | EK-G00015A1-1 | Step 2.5. |
| Motorized micromanipulator | Sutter | MP-285 | Step 3.2.4. |
| Mounting base | Thorlabs | BA1S | Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with PH4 and TR2 |
| Mounting post | Thorlabs | P14 | Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with PB2 |
| Mounting post base | Thorlabs | PB2 | Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with P14 |
| Mounting post bracket | Thorlabs | C1515 | Step 2.6. Used in combination with right-angle bracket and headplate holder |
| Optical post | Thorlabs | TR2 | Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and PH4 |
| Phosphate-buffered saline | Ν/Α | Ν/Α | Step 3.2.2. Protocol: Cold Spring Harbor Protocols 2006, doi: 10.1101/pbd.rec8247 |
| Photodiode | Thorlabs | FDS010 | Step 1.2. |
| Photon timing counting module | Becker and Hickl | SPC-150 | Step 1.1. |
| Plasmid: tAKARα (CAG-tAKARα-WPRE) | Addgene | 119913 | Step 3.1.3. |
| Post holder | Thorlabs | PH4 | Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and TR2 |
| Right-angle bracket | Thorlabs | AB90 | Step 2.6 Used in combination with mounting post bracket and headplate holder |
| Rotation sensor | US digital | MA3-A10-250-N | Step 2.4. |
| Rubber mat | Rubber-Cal | B01DCR5LUG | Step 2.1. |
| Shaft coupling (1/4 inch x 1/4 inch) | McMaster | 6208K433 | Steps 2.3. and 2.4. |
| ScanImage 3.6 | Svoboda Lab/Vidrio Technology | N/A | Steps 5.9. and 6.1. |
| Signal splitter | Becker and Hickl | HPM-CON-02 | Step 1.3.1. |
| Stainless steel axle (diameter 1/4 inch, L = 12 inch) | McMaster | 1327K66 | Step 2.3. |
| Stereotaxic alignment systsem | David kopf | 1900 | Steps 3.2. and 4.1. modified; Sutter micromanipulator, custom-made injection needle holder, hydraulic micromanipulator |
| Two-photon microscope | N/A | N/A | Section 5. Built based on Modular in vivo multiphoton microscopy system (MIMMS) from HHMI Janelia Research Campus (https://www.janelia.org/open-science/mimms) |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 14006 | Step 3.2.6. |
| Virus: tAKARα (AAV2/1 hSyn-tAKARα-WPRE) | Addgene | 119921 | Step 3.2.2. |
| White PE foam roller (8 x 12 inch) | Fabrication enterprises INC. | 30-2261 | Step 2.1.1. |
| White polystyrene fom ball halves | GrahamSweet | 200mm diameter 2 hollow halves | Step 2.1.1. |
| Zipkicker | PACER | PT29 | Step 4.3. Hardening accelerator |
References
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