Flusso Analisi citometrica delle specie di ossigeno reattivo mitocondriale nelle cellule staminali e semigeniche Murine Hematopoietic e MLL-AF9 Driven Leucemia
Summary
Descriviamo un metodo per l’utilizzo di citometria a flusso multiparametrico per rilevare le specie di ossigeno reattivo mitocondriale (ROS) in cellule staminali e progenitrici (HSPC) e cellule leucemiche da un modello murino di leucemia mieloide acuta (AML) MLL-AF9.
Abstract
Vi presentiamo un approccio citometrico a flusso per analizzare il ROS mitocondriale in varie popolazioni di cellule staminali e progenitrici derivate da mandorone vivo (BM) da topi sani e topi con AML guidati da MLL-AF9. In particolare, descriviamo un processo di colorazione delle cellule in due fasi, in base al quale le cellule BM sane o leucemia vengono prima macchiate con un colorante fluorogenico che rileva i superossidi mitocondriali, seguito dalla colorazione con anticorpi monoclonali fluoromemici che vengono utilizzati per distinguere varie popolazioni di progenitori ematopoietici sani e maligni. Forniamo anche una strategia per l’acquisizione e l’analisi dei campioni per citometria di flusso. L’intero protocollo può essere eseguito in un lasso di tempo Mettiamo inoltre in evidenza le variabili chiave da considerare, nonché i vantaggi e i limiti del monitoraggio della produzione ROS nel compartimento mitocondriale delle sottopopolazioni di stelo e leucemia e progenie vive utilizzando coloranti fluogenici per citometria di flusso . Inoltre, presentiamo dati che l’abbondanza mitocondriale ROS varia tra distinti sottopopolazioni HSPC sani e progenitori di leucemia e discutiamo le possibili applicazioni di questa tecnica nella ricerca ematologica.
Introduction
Le specie REattive dell’ossigeno (ROS) sono molecole altamente reattive derivate dall’ossigeno molecolare. La posizione cellulare più ben definita della produzione di ROS è il mitocondria, dove gli elettroni che passano attraverso la catena di trasporto degli elettroni (ETC) durante il fosforoostoslazione ossidativa (OXPHOS) vengono assorbiti dall’ossigeno molecolare che porta alla formazione di uno specifico tipo di ROS chiamato superoossidi1. Attraverso le azioni di una serie di enzimi, chiamati disinmutasi di superossido o SOD, i superolisi vengono convertiti in perossidi di idrogeno, che vengono successivamente neutralizzati in acqua da enzimi come catalasi o perossioni glutathione (GPX). Le perturbazioni nei meccanismi di regolazione del ROS possono portare all’eccesso di produzione di ROS, spesso indicato come stress ossidativo, che hanno conseguenze cellulari dannose e potenzialmente letali come il danno da macromolecola (cioè DNA, proteine, lipidi). Inoltre, lo stress ossidativo è legato a diverse patologie, come il diabete, le malattie infiammatorie, l’invecchiamento e i tumori2,3,4. Per mantenere l’omeostasi redox e prevenire lo stress ossidativo, le cellule possiedono una varietà di meccanismi di regolazione ROS5.
I livelli fisiologici di alcuni ROS sono necessari per una corretta ematopoiesi embrionale e adulta6. Tuttavia, l’eccesso di ROS è associato al danno al DNA, alla differenziazione cellulare e all’esaurimento dello stelo ematopoietico e del pool progenitore. Ci sono anche prove che le alterazioni nella biologia redox possono differire tra leucemia e cellule sane. Ad esempio, i livelli di ROS tendono ad essere più elevati nelle cellule acute di leucemia mieloide (AML) rispetto alle loro controparti sane e altri studi hanno suggerito che le cellule staminali della leucemia mantengono un basso livello costante di ROS per la sopravvivenza7,8. È importante sottolineare che le strategie per capitalizzare terapeuticamente queste differenze redox hanno mostrato promessa in diverse impostazioni di cancro umano9,10. Pertanto, i saggi che consentono la valutazione dei livelli di ROS nei modelli murini possono migliorare la nostra comprensione di come queste specie contribuiscono alla fisiologia cellulare e alla patogenesi della malattia, nonché potenzialmente fornire una piattaforma per valutare l’efficacia nuove terapie anti-cancro di mira redox.
Protocol
Representative Results
Discussion
I coloranti fluorogenici che sono stati sviluppati per la rilevazione di ROS sono spesso valutati in cellule fisse mediante microscopia o in cellule vive per citometria di flusso22. La valutazione citometrica del flusso del ROS mitocondriale nelle cellule BM che utilizza nodi fluorogeniche MItocondriali ROS ha due vantaggi principali: 1) Si tratta di una tecnica semplice e veloce adatta per l’analisi delle cellule vive e 2) consente di distinguere e analizzare raro a livello di singola cellula nel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal Fox Chase Cancer Center Board of Directors (DDM), l’American Society of Hematology Scholar Award (SMS), American Cancer Society RSG (SMS) e dal Department of Defense (Award: W81XWH-18-1-0472).
Materials
| Heat inactivated FBS | VWR Seradigm LIFE SCIENCE | 97068-085 | Media |
| Penicillin Streptomycin | Corning | 30-002-CI | Media |
| PBS | Fisher Scientific | BP399-20 | Buffer |
| 15 mL conical tube | BD falcon | 352096 | Tissue Culture Supplies |
| 50 mL conical tube | BD falcon | 352098 | Tissue Culture Supplies |
| 40 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22-363-547 | Tissue Culture Supplies |
| RBC Lysis Buffer | Fisher Scientific | 50-112-9751 | Tissue Culture Supplies |
| Menadione sodium Bisulfite | Sigma aldrich | M5750 | Pro-oxidant |
| NAC | Sigma aldrich | A7250 | Anti-oxidant |
| CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11 | Biolegend | 100310 | Antibody |
| CD4 PE-Cy5 clone RM4-5 | eBioscience | 15-0041-81 | Antibody |
| CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7 | eBioscience | 15-0081-81 | Antibody |
| CD19 PE-Cy5 clone 6D5 | Biolegend | 115510 | Antibody |
| B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2 | Biolegend | 103210 | Antibody |
| Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5 | Biolegend | 108410 | Antibody |
| Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119 | Biolegend | 116210 | Antibody |
| CD48 PE-Cy5 clone HM48-1 | Biolegend | 103420 | Antibody |
| CD117 APC-Cy7 clone 2B8 | Biolegend | 105825 | Antibody |
| Sca1 peacific Blue clone D7 | Biolegend | 108120 | Antibody |
| CD150 APC clone TC15-12F12.2 | Biolegend | 115909 | Antibody |
| CD34 FITC clone RAM34 | BD Bioscience | 553733 | Antibody |
| CD45.2 APC clone 104 | Biolegend | 1098313 | Antibody |
| MitoSOX Red | ThermoFisher Scientific | M36008 | Dye |
| Mitotracker Green | ThermoFisher Scientific | M7514 | Dye |
| Live/dead Yellow Dye | ThermoFisher Scientific | L34967 | Dye |
References
- Dröse, S., Brandt, U. Molecular mechanisms of superoxide production by the mitochondrial respiratory chain. Advances in experimental medicine and biology. 748, 145-169 (2012).
- Gerber, P. A., Rutter, G. A. The Role of Oxidative Stress and Hypoxia in Pancreatic Beta-Cell Dysfunction in Diabetes Mellitus. Antioxidant & Redox Signaling. 26 (10), 501-518 (2017).
- Höhn, A., et al. Happily (n)ever after: Aging in the context of oxidative stress, proteostasis loss and cellular senescence. Redox Biology. 11, 482-501 (2017).
- Reuter, S., Gupta, S. C., Chaturvedi, M. M., Aggarwal, B. B. Oxidative stress, inflammation, and cancer: how are they linked. Free Radical Biology & Medicine. 49 (11), 1603-1616 (2010).
- Lee, B. W. L., Ghode, P., Ong, D. S. T. Redox regulation of cell state and fate. Redox Biology. 2213-2317 (18), 30899 (2018).
- Harris, J. M., et al. Glucose metabolism impacts the spatiotemporal onset and magnitude of HSC induction in vivo. Blood. 121, 2483-2493 (2013).
- Hole, P. S., Darley, R. L., Tonks, A. Do reactive oxygen species play a role in myeloid leukemias. Blood. 117, 5816-5826 (2011).
- Lagadinou, E. D., et al. BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).
- Di Marcantonio, D., et al. Protein Kinase C Epsilon Is a Key Regulator of Mitochondrial Redox Homeostasis in Acute Myeloid Leukemia. Clinical Cancer Research. 24 (3), 608-618 (2018).
- Glasauer, A., Chandel, N. S. Targeting antioxidants for cancer therapy. Biochemical Pharmacology. 92 (1), 90-101 (2014).
- Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
- Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. Phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Lo Celso, C., Scadden, D. T. Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs). Journal of Visualized Experiments. (157), (2007).
- Kalaitzidis, D., et al. mTOR complex 1 plays critical roles in hematopoiesis and Pten-loss-evoked leukemogenesis. Cell Stem Cell. 11 (3), 429-439 (2012).
- Sykes, S. M., et al. AKT/FOXO signaling enforces reversible differentiation blockade in myeloid leukemias. Cell. 146 (5), 697-708 (2011).
- Kalaitzidis, D., Neel, B. G. Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells. PLoS One. 3 (11), 3776 (2008).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Yilmaz, O. H., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Mooney, C. J., Cunningham, A., Tsapogas, P., Toellner, K. M., Brown, G. Selective expression of flt3 within the mouse hematopoietic stem cell compartment. International Journal Molecular Sciences. 18 (5), (2017).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. I. SLAM family markers resolve functional distinct sub-populations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
- Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment. Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1178 (2010).
- Mukhopadhyay, P., Rajesh, M., Haskó, G., Hawkins, B. J., Madesh, M., Pacher, P. Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy. Nature Protocols. 2 (9), 2295-2301 (2007).
- Camargo, F. D., Chambers, S. M., Drew, E., McNagny, K. M., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies. Blood. 107 (2), 501-507 (2006).
- Morita, Y., Ema, H., Yamazaki, S., Nakauchi, H. Non-side-population hematopoietic stem cells in mouse bone marrow. Blood. 108 (8), 2850-2856 (2006).
- de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
- Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment. Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).
- Somervaille, T. C., Cleary, M. L. Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).
- Hao, X., et al. Metabolic Imaging Reveals a Unique Preference of Symmetric Cell Division and Homing of Leukemia-Initiating Cells in an Endosteal Niche. Cell Metabolism. 29 (4), 950-965 (2019).
