Summary

Un saggio per quantificare il legame proteino-RNA nei batteri

Published: June 12, 2019
doi:

Summary

In questo metodo, quantifichiamo l’affinità legante delle proteine leganti l’RNA (RBP) per cognare e siti di legame non-cognati utilizzando un semplice, dal vivo, saggio reporter nelle cellule batteriche. Il saggio si basa sulla repressione di un gene reporter.

Abstract

Nella fase di avvio della traduzione delle proteine, il ribosoma si lega alla regione di avvio dell’mRNA. L’avvio della traduzione può essere bloccato legando una proteina legante RNA (RBP) alla regione di avvio dell’mRNA, che interferisce con il legame ribosomico. Nel metodo presentato, utilizziamo questo fenomeno di blocco per quantificare l’affinità vincolante degli RBP ai loro siti di legame cognati e non cognati. Per fare questo, inseriamo un sito di rilegatura di test nell’area di avvio di un mRNA reporter e induciamo l’espressione del test RBP. Nel caso dell’associazione RBP-RNA, abbiamo osservato una repressione sigmoidale dell’espressione dei reporter in funzione della concentrazione di RBP. Nel caso di nessuna affinità o di affinità molto bassa tra sito vincolante e RBP, non è stata osservata alcuna repressione significativa. Il metodo viene eseguito in cellule batteriche vive e non richiede macchinari costosi o sofisticati. È utile per quantificare e confrontare tra le affinità di legame di diversi RBP che sono funzionali nei batteri con una serie di siti di legame progettati. Questo metodo può essere inappropriato per i siti di rilegatura con elevata complessità strutturale. Ciò è dovuto alla possibilità di repressione dell’avvio ribosomico da parte di una complessa struttura di mRNA in assenza di RBP, che si tradurrà in una minore espressione genica del reporter basale, e quindi meno conlacuabile repressione dei reporter sul legame RBP.

Introduction

Negli ultimi decenni la regolazione post-trascrizione basata sulla proteina legante dell’RNA (RBP), in particolare la caratterizzazione dell’interazione tra RBP e RNA, è stata ampiamente studiata negli ultimi decenni. Ci sono diversi esempi di down-regolazione traslazionale nei batteri originari di RBP che inibiscono, o direttamente in competizione con, ribosoma legame1,2,3. Nel campo della biologia sintetica, le interazioni RBP-RNA stanno emergendo come uno strumento significativo per la progettazione di circuiti genetici basati sulla trascrizione4,5. Pertanto, c’è un aumento della domanda di caratterizzazione di tali interazioni RBP-RNA in un contesto cellulare.

I metodi più comuni per studiare le interazioni proteina-RNA sono l’analisi elettroforica del cambio di mobilità (EMSA)6, che è limitato alle impostazioni in vitro, e vari saggi pull-down7, tra cui il metodo CLIP8,9 . Mentre tali metodi consentono la scoperta di siti di legame de novo RNA, soffrono di inconvenienti come protocolli ad alta intensità di lavoro e costose reazioni di sequenziamento profondo e possono richiedere un anticorpo specifico per il pull-down RBP. A causa della natura suscettibile dell’RNA al suo ambiente, molti fattori possono influenzare le interazioni RBP-RNA, sottolineando l’importanza di interrogare il legame RBP-RNA nel contesto cellulare. Ad esempio, noi e altri abbiamo dimostrato differenze significative tra le strutture di RNA in vivo e in vitro10,11.

Sulla base dell’approccio di uno studio precedente 12, abbiamo recentemente dimostrato10 che quando si posizionano siti di legame pre-progettati per gli RBP capsidi dei batteriofages GA13, MS214, PP715e Q regione di avvio della traduzione di un reporter mRNA, espressione reporter è fortemente repressa. Vi presentiamo un metodo relativamente semplice e quantitativo, basato su questo fenomeno di repressione, per misurare l’affinità tra gli RBP e il loro corrispondente sito di legame dell’RNAin vivo.

Protocol

1. Preparazione del sistema Progettazione di plasmidi di sito di rilegatura Progettare la cassetta del sito di rilegatura come illustrato nella Figura 1. Ogni minigene contiene le seguenti parti (da 5 a 3′): sito di restrizione Eagl, 40 basi dell’estremità 5′ del gene di resistenza kanamycin (Kan), promotore di pLac-Ara, sito di rilegatura ribosomi (RBS), AUG del gene mCherry, un distanziale (che si allarga un sito di legame RBP, 80 basi dell’estremità …

Representative Results

Il metodo presentato utilizza la competizione tra un RBP e il ribosoma per il legame con la molecola mRNA (Figura 1). Questa concorrenza si riflette nella diminuzione dei livelli di mCherry in funzione dell’aumento della produzione di RBP-mCerulean, a causa delle crescenti concentrazioni di induttore. Nel caso di aumento della fluorescenza mCerulea, senza cambiamenti significativi in mCherry, viene dedotta una mancanza di legame RBP. I risultati rappresentati…

Discussion

Il metodo descritto in questo articolo facilita la misurazione quantitativa in vivo dell’affinità di legame RBP-RNA nelle cellule di E. coli. Il protocollo è relativamente semplice e può essere condotto senza l’uso di macchinari sofisticati e l’analisi dei dati è semplice. Inoltre, i risultati vengono prodotti immediatamente, senza il tempo di attesa relativamente lungo associato ai risultati di sequenziamento (NGS) di prossima generazione.

Una limitazione a questo metodo è che f…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dal programma I-CORE del Comitato di pianificazione e budgeting e dalla Israel Science Foundation (Grant no. 152/11), Marie Curie Reintegration Grant No. PCIG11-GA- 2012-321675 e dal programma di ricerca e innovazione Orizzonte 2020 dell’Unione europea nell’ambito dell’accordo di sovvenzione n. 664918 – MRG-Grammar.

Materials

Ampicillin sodium salt SIGMA A9518
Magnesium sulfate (MgSO4) ALFA AESAR 33337
48 plates Axygen P-5ML-48-C-S
8- lane plates Axygen RESMW8I
96-well plates Axygen P-DW-20-C
96-well plates for plate reader Perkin Elmer 6005029
ApaLI NEB R0507
Binding site sequences Gen9 Inc. and Twist Bioscience see Table 1
E. coli TOP10 cells Invitrogen C404006
Eagl-HF NEB R3505
glycerol BIO LAB 071205
incubator TECAN liconic incubator
Kanamycin solfate SIGMA K4000
KpnI- HF NEB R0142
ligase NEB B0202S
liquid-handling robotic system TECAN EVO 100, MCA 96-channel
Matlab analysis software Mathworks
multi- pipette 8 lanes Axygen BR703710
N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL) cayman K40982552 019
PBS buffer Biological Industries 020235A
platereader TECAN Infinite F200 PRO
Q5 HotStart Polymerase NEB M0493
RBP seqeunces Addgene 27121 & 40650 see Table 2
SODIUM CHLORIDE (NaCL) BIO LAB 190305
SV Gel and PCR Clean-Up System Promega A9281
Tryptone BD 211705

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Cite This Article
Katz, N., Cohen, R., Atar, O., Goldberg, S., Amit, R. An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria. J. Vis. Exp. (148), e59611, doi:10.3791/59611 (2019).

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