In Vitro ELISA Testi Kuduz Aşısı Potens Değerlendirmek için
Summary
Burada kuduz aşılarında immünojenik glikoprotein içeriğini belirlemek için dolaylı bir ELISA sandviç immünoyakalama açıklar. Bu test glikoprotein düzelticileri tanıyan nötralize monoklonal antikor (mAb-D1) kullanır. Üretim sırasında aşı potens tutarlılığını takip etmek için in vivo NIH testine alternatiftir.
Abstract
Hayvan refahı için giderek artan küresel endişe üreticileri ve Ulusal Kontrol Laboratuvarları (OMCLs) Değiştirme, Azaltma ve Laboratuvar hayvan testleri arıtma için 3Rs stratejisi takip teşvik etmektedir. Kuduz aşısı nın gücünü değerlendirmek için NIH testine alternatif olarak dSÖ ve Avrupa düzeylerinde in vitro yaklaşımların geliştirilmesi önerilmektedir. Kuduz virüsü (RABV) partikülünün yüzeyinde glikoprotein indükleyicileri Viral Nötralize Antikorları (VNAb) oluşturmak için büyük immünojeni oluşturur. Monoklonal Antikorların (mAb-D1) glikoproteinin trimerik formunu tanıdığı bir ELISA testi, aşı serilerinin üretimiyle birlikte yerli katlanmış trimerik glikoproteinin içeriğini belirlemek için geliştirilmiştir. Bu in vitro potens testi NIH testi ile iyi bir uyum gösterdi ve RABV aşı üreticileri ve OMCLs tarafından ortak çalışmalarda uygun bulunmuştur. Hayvan kullanımından kaçınmak yakın gelecekte ulaşılabilir bir hedeftir.
Sunulan yöntem, trimerik RABV glikoproteininin iii (aa 330-338) antijenik bölgelerini tanıyan mAb-D1 kullanılarak dolaylı elisa sandviç immünoyakalamasına dayanmaktadır. mAb-D1, aşı da bulunan glikoprotein düzelticilerin hem kaplaması hem de tespiti için kullanılır. Epitop konformasyonel özellikleri nedeniyle tanındığından, potansiyel olarak denatüre glikoprotein (daha az immünojenik) mAb-D1 tarafından yakalanıp tespit edilemez. Test edilecek aşı mAb-D1 ile duyarlı bir plaka içinde kuluçkaya yatırılır. Bağlı trimerik RABV glikoproteinler tekrar mAb-D1 eklenerek tanımlanır, peroksidaz ile etiketlenir ve daha sonra substrat ve kromojen varlığında ortaya çıkar. Test edilen aşı ve referans aşı için ölçülen emiciliğin karşılaştırılması immünojenik glikoprotein içeriğinin belirlenmesine olanak sağlar.
Introduction
50 yıldan fazla olduğundan, NIH testi1 toplu yayından önce kuduz aşısı gücünü değerlendirmek için altın standart bir yöntem olarak kullanılır. Bu test, 14 gün sonra kuduz virüsü (RABV) türü olan Challenge Virus Standard (CVS) ile birlikte test edilecek aşı ile fare gruplarının intraperitoneal bağışıklamalarından oluşur. Potens IC meydan hayatta farelerin oranında değerlendirilir. Who2 ve Avrupa Farmakopesi3 hala aşı potens değerlendirmek için NIH testi gerektirir rağmen, Bu test çeşitli engeller uğrar: sonuçlar son derece değişken4; enfeksiyöz RABV meydan okuma sırasında kullanılır ve bu hem teknik beceri hem de sıkı biyogüvenlik önlemleri gerektirir; hayvanların çok sayıda kullanılır ve meydan şiddeti ciddi etikendişeleri5 yükseltir. Bu testin daha az ciddi bir varyasyonu geliştirilmiştir: intra-periton bağışıklama iki hafta sonra, fareler IC tarafından meydan değil ama kanama lı ve serumda spesifik RABV nötralize antikorların varlığı için test edilmiştir (VNAbs) bir in vitro nötralizasyon testi kullanarak. Ancak, bu test hala veteriner aşıları için kullanımda olmasına rağmen laboratuvar farelerin çok sayıda kurban gerektirir6,7 ve insan aşıları için kabul edilmiştir8.
Şu andan itibaren, hem Uluslararası9 hem de Avrupa10 önerisi, üreticileri ve Ulusal Kontrol Laboratuvarlarını (Official Medicine Control Laboratories – OMCLs) 3R stratejisi olarak adlandırılan laboratuvar hayvan testlerinin değiştirilmesi, azaltılması ve iyileştirilmesi konusunda teşvik etmektedir. Avrupa Direktifi 2010/63/EU (2013/01/01 yılından bu yana yürürlükte) hayvanların korunması ve refahı ile ilgili de kuduz aşılarının Kalite Kontrolü ile ilgili aşı üreticileri ve laboratuvarları için kısıtlamaları güçlendirdi yanı sıra kuduz araştırma11. Sonuç olarak, alternatif in vitro yaklaşımların geliştirilmesi, doğrulanması ve kullanımı artık bir öncelik haline gelmiştir. Bu sadece etik olarak sağlam değil, aynı zamanda toplu test maliyetlerini azaltabilir ve hafta yerine saat sonuçları için süre kısaltmak3.
RABV parçacığının yüzeyinde, glikoprotein trimerik formu benimser12,13,14,15,16. Kuduz aşısında, bu yerli trimerik form vnabs indükleyen büyük immünojen oluşturur17 ise monomerik, çözünür veya denatüre glikoproteinler kötü immünojenik18,19. Bu nedenle, aşı üretim süreci boyunca glikoprotein düzelticilerin korunması optimal immünojenik potansiyelin korunması için iyi bir göstergedir. Antikor-bağlayıcı-test20,,21, tek radyal immünodiffüzyon (SRD) testi22 ve ELISA testi23,24,,25,26,,27 gibi çeşitli immünokimyasal yöntemler, kuduz aşılarında antijen içeriğini ölçmek için WHO Teknik Rapor Serisi2 ve Avrupa monografisi3 tarafından tavsiye edilir.24 Bu aşı üretiminin tutarlılığını izlemek için üreticiler tarafından kullanılan ve OMCL tarafından insan aşıları28toplu tutarlı formülasyon değerlendirmek için, NIH testi hala potens için kabul olsa bile.
Ancak, tüm bu immünokimyasal yöntemler eşdeğer değildir. SRD testi membran demirli süsleyiciler değiştirebilir ve glikoprotein,22,29çözünür veya denatüre formu neden olabilir bir ön tedavi gerektirir. Bu nedenle, SRD bir aşı çok immünojenite kusurlu bir değerlendirme ile sonuçlanan immünojenik ve non-immünojenik glikoproteinler arasında ayrım çok verimli değildir. Buna karşılık, ELISA testi dahaduyarlıdır 22, glikoproteinin doğal yapısını korur, ve glikoprotein doğal katlanmış trimers içeriğini belirlemek için daha uygundur. ELISA testi tavşan poliklonal veya fare monoklonal anti-glikoprotein antikorları saflaştırılmış veya amonyum sülfat ile konsantre kullanabilirsiniz. Çalışmalar, NIH testi ile aşılarda ELISA tarafından değerlendirilen antijen içeriği arasında iyi bir uyum olduğunu göstermiş ve ELISA yöntemlerinin in vitro potens testi için uygun olduğu sonucuna varmıştır. Bu ELISA testleri en azından ek olabilir ya da hatta NIH testi4,26,27,30,31,32,33değiştirebilirsiniz savunucuları ., Bugün, Avrupa Farmakopesi NIH testi3alternatif olarak doğrulanmış serolojik veya immünokimyasal tahlillerin kullanılmasını önerir. Aşı potens için hayvan kullanımıtam kaçınma gerçekçi bir bakış açısı haline gelmiştir.
Aşağıda sunulan yöntem, trimerik RABV glikoprotein15,34antijenik siteleri III (aa 330-338) tanır bir fare monoklonal antikor klonu (mAb-D1) kullanarak dolaylı bir ELISA sandviç immünoyakalama dayanmaktadır. Bu yöntem başlangıçta Institut Pasteur26geliştirilmiştir ,30 sonra optimize edilmiş ve Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des produits de santé tarafından doğrulandı (ANSM) laboratuvar, yani, Fransız OMCL4,33. mAb-D1 hem plakayı algılamak hem de yakalanan antijeni tespit etmek için kullanılır. Bu glikoprotein düzelticiler, yani, immünojenik RABV antijeninin spesifik niceliklenmesine olanak sağlar. Algılama için kullanılan mAb-D1 peroksidaz ile etiketlenir, hangi substrat ve kromojen varlığında ortaya çıkar. Test edilen aşı ve referans aşı için ölçülen emiciliğin karşılaştırılması immünojenik glikoprotein içeriğinin belirlenmesine olanak sağlar. RABV glikoprotein35’infarklı antijenik bölgelerini tanıyan farklı mAb’ler için aynı tip bir titreşme uygulanabileceği dikkat ivedidir. Amonyum sülfat anti-glikoprotein poliklonal tavşan immünglobulinleri G (IgG) veya monoklonal fare globulinleri elde etme ve arındırma veya konsantre etme yöntemi, peroksidaz ile antikorları bir araya getirmek için kullanılan yöntemle birlikte daha önce36 olarak açıklanmıştır37.
Protocol
Representative Results
Discussion
mAb-D1 tarafından tanınan epitop, rabv glikoproteininin antijenik bölgesi III’te yer alır ve bu sadece VNAb’lerin indüksiyonu için immündominant olmakla kalmamış, aynı zamanda nörovikurallılık, patojenite40,41 ve reseptör tanıma42’deyer almaktadır. Glikoprotein boyunca başka bir önemli antijenik site vardır, site II43, karşı birkaç MAbs mAb-WI-111235gibi izole edilmişti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Sylvie Morgeaux ve Dr. Jean-Michel Chapsal, aşı serileri konusunda ELISA titreşmelerini oluşturmak ve uluslararası çalıştaylar ve işbirlikçi çalışmalar düzenlemek için temel katılımları için kabul edilmelidir. Sabrina Kali’ye el yazmasının eleştirel okuması için teşekkür ederiz. Dr. Pierre Perrin mAb-D1’in izolasyon ve karakterizasyonundan sorumluydu. Bu çalışma ağırlıklı olarak Institut Pasteur finansmanı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Class II Biological Safety Cabinet | ThermoFisher Scientific | 10445753 | if titrating live virus |
| Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates, 400 µL, MAXISORP | ThermoFisher Scientific | 439454 | good for binding to the loaded antibody |
| Equip Labo Polypropylene Laboratory Fume Hood | ThermoFisher Scientific | 12576606 | for the preparation of sulfuric acid |
| Immunology Plate Strong Adsorption MAXISORP Flat Bottom Well F96 |
Dutscher | 55303 | good for binding to the loaded antibody |
| Microplate Sealing Tape(100 sheets) | ThermoFisher Scientific | 15036 | |
| Microplate single mode reader Sunrise | TECAN | ||
| Microplate shaker-incubator | Dutscher | 441504 | |
| Microplate washer Wellwash | ThermoFisher Scientific | 5165000 | |
| Multichannel pipette (30-300 µL) 12 channels | ThermoFisher Scientific | 4661180N | |
| Single Channel pipettes (Kit 2 : Finnpipettes F2 0.2-2 μL micro, 2-20 μL, 20-200 μL & 100-1000 μL) | ThermoFisher Scientific | 4700880 |
References
- Seligmann, E. B. The NIH test for potency. Laboratory Techniques in Rabies. , 279-286 (1973).
- Annex 2. Recommendations for inactivated rabies vaccine for human use produced in cell substrates and embryonated eggs. WHO Technical Report Series. 941, 83-132 (2007).
- . Rabies vaccine for human use prepared in cell cultures. European Pharmacopoeia. , (2008).
- Gibert, R., Alberti, M., Poirier, B., Jallet, C., Tordo, N., Morgeaux, S. A relevant in vitro ELISA test in alternative to the in vivo NIH test for human rabies vaccine batch release. Vaccine. 31, 6022-6029 (2013).
- Stokes, W., et al. Report on the international workshop on alternative methods for human and veterinary rabies vaccine testing: state of the science and planning the way forward. Biologicals. 40 (5), 369-381 (2012).
- Krämer, B., Bruckner, L., Daas, A., Milne, C. Collaborative study for validation of a serological potency assay for rabies vaccine (inactivated) for veterinary use. Pharmeuropa Bio & Scientific Notes. 2, 37-55 (2010).
- Krämer, B., Kamphuis, E., Hanschmann, K. M., Milne, C., Daas, A., Duchow, K. A multi-dose serological assay suitable to quantify the potency of inactivated rabies vaccines for veterinary use. Biologicals. 41, 400-406 (2013).
- Fitzgerald, E. A., Gallagher, M., Hunter, W. S., Seligmann, E. B. Use of the antibody assay in immunized mice for the determination of rabies vaccine potency. Developments in Biological Standardization. 40, 183-186 (1978).
- Milstien, J., Grachev, V., Padilla, A., Griffiths, E., Brown, F., Cussler, K., Hendriksen, C. WHO activities towards the three Rs in the development and control of biological products. Replacement, reduction and refinement of animal experiments in the development and control of biological products. , 31-39 (1996).
- Behr-Gross, M. E., Spieser, J. M. Contributions of the European OMCL Network and Biological Standardisation Programme to animal Welfare. ALTEX-Alternatives to Animal Experimentation. 23, 21-28 (2006).
- . Directive 2010/63/EU of the European Parliament and the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Official Journal of European Union. L276, 33-79 (2010).
- Whitt, M. A., Buonocore, L., Prehaud, C., Rose, J. K. Membrane fusion activity, oligomerization and assembly of the rabies virus glycoprotein. Virology. 185 (2), 681-688 (1991).
- Gaudin, Y., Ruigrok, R. W., Tuffereau, C., Knossow, M., Flamand, A. Rabies virus glycoprotein is a trimer. Virology. 187, 627-632 (1992).
- Roche, S., Gaudin, Y. Characterization of the equilibrium between the native and fusion-inactive conformation of rabies virus glycoprotein indicates that the fusion complex is made of several trimers. Virology. 297 (1), 128-135 (2002).
- Desmézières, E., Maillard, A. P., Gaudin, Y., Tordo, N., Perrin, P. Differential stability and fusion activity of Lyssavirus glycoprotein trimers. Virus Research. 91 (2), 181-187 (2003).
- Koraka, P., et al. A recombinant rabies vaccine expressing the trimeric form of the glycoprotein confers enhanced immunogenicity and protection in outbred mice. Vaccine. 32 (36), 4644-4650 (2014).
- Wiktor, T., Gyorgy, E., Schlumberger, D., Sokol, F., Koprowski, H. Antigenic properties of rabies virus components. Journal of Immunology. 110, 269-276 (1973).
- Gamoh, K., Senda, M., Itoh, O., Muramatsu, M., Hirayama, N., Koike, R., et al. Use of ELISA for in vitro potency test of rabies vaccines for animal use. Biologicals. 24, 95-101 (1996).
- Dietzschold, B., Wiktor, T., Wunner, W., Varrichio, A. Chemical and immunological analysis of the rabies soluble glycoprotein. Virology. 124, 330-337 (1983).
- Fitzgerald, E., Green, O., Seligmann, E. Rabies vaccine potency testing: a comparison between the antibody-binding test and the NIH test. Symposia Series in Immunobiological Standard. 21, 300-307 (1974).
- Barth, R., Groβ-Albenhausen, E., Jaeger, O., Milcke, L. The antibody-binding test, a useful method for quantitative determination of inactivated rabies virus antigen. Journal of Biological Standardization. 9, 81-89 (1981).
- Ferguson, M., Schild, G. A single-radial-immunodiffusion technique for the assay of rabies glycoprotein antigen: application for the potency tests of vaccines against rabies. Journal of General Virology. 59, 197-201 (1982).
- Atanasiu, P., Perrin, P., Delagneau, J. F. Use of an enzyme immunoassay with protein A for rabies antigen and antibody determination. Developments in Biological Standardization. 46, 207-215 (1980).
- van der Marel, P., van Wezel, A. Quantitative determination of rabies antigen by ELISA. Developments in Biological Standardization. 50, 267-275 (1981).
- Adamovicz, P., Aguillon, F., David, A., Le Fur, R., Mazert, M. C., Perrin, P., et al. The use of various immunochemical, biochemical and biological methods for the analysis of rabies virus production in tissue cultures. Developments in Biological Standardization. 55, 191-197 (1984).
- Lafon, M., Perrin, P., Versmisse, P., Sureau, P. Use of monoclonal antibody for quantification of rabies vaccine glycoprotein by enzyme immunoassay. Journal of Biological Standardization. 13, 295-301 (1985).
- Thraenhart, O., Ramakrishnan, K. Standardization of an enzyme immunoassay for the in vitro potency assay of inactivated tissue culture rabies vaccines: determination of the rabies virus glycoprotein with polyclonal antisera. Journal of Biological Standardization. 17, 291-309 (1989).
- Council of Europe. . Official Authority Batch release of Rabies vaccines Guideline. , (2019).
- Ferguson, M., Seagroatt, V., Schild, G. A collaborative study on the use of single radial immunodiffusion for the assay of rabies virus glycoprotein. Developments in Biological Standards. 12, 283-294 (1984).
- Perrin, P., Morgeaux, S., Sureau, P. In vitro rabies vaccine potency appraisal by ELISA: advantages of the immunocapture method with a neutralizing anti-glycoprotein monoclonal antibody. Biologicals. 18, 321-330 (1990).
- Rooijakkers, E. J., Uittenbogaard, J. P., Groen, J., Osterhaus, A. D. Rabies vaccine potency control: comparison of ELISA systems for antigenicity testing. Journal of Virological Methods. 58, 111-119 (1996).
- Rooijakkers, E. J., Uittenbogaard, J. P., Groen, J., van Herwijnen, J., Osterhaus, A. D., Brown, F., Cussler, K., Hendriksen, C. . Development and evaluation of alternative testing methods for the in vivo NIH potency test used for the quality control of inactivated rabies vaccines. , 137-145 (1996).
- Fournier-Caruana, J., et al. Inactivated rabies vaccine control and release: use of an ELISA method. Biologicals. 31, 9-16 (2003).
- Sissoëff, L., Mousli, M., England, P., Tuffereau, C. Stable trimerization of recombinant rabies virus glycoprotein ectodomain is required for interaction with the p75NTR receptor. Journal of General Virology. 86, 2543-2552 (2005).
- Morgeaux, S., et al. Replacement of in vivo human rabies vaccine potency testing by in vitro glycoprotein quantification using ELISA – Results of an international collaborative study. Vaccine. 35 (6), 966-971 (2017).
- Lafon, M., Meslin, F. X., Kaplan, M. N., Kopowski, H. Techniques for the production, screening and characterisation of monoclonal antibodies. Laboratory techniques in rabies, 4th Edition. , 133-144 (1996).
- Perrin, P., Meslin, F. X., Kaplan, M. N., Kopowski, H. Techniques for the preparation of rabies confugates. Laboratory techniques in rabies, 4th Edition. , 433-444 (1996).
- Barth, R., Diderrich, G., Weinmann, E. NIH test, a problematic method for testing potency of inactivated rabies vaccine. Vaccine. 6, 369-377 (1988).
- Jallet, C., et al. Chimeric lyssavirus glycoproteins with increased immunological potential. Journal of Virology. 73, 225-233 (1999).
- Dietzschold, B., et al. Characterization of an antigenic determinant of the glycoprotein that correlates with pathogenicity of rabies virus. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 80, 70-74 (1983).
- Seif, L., Coulon, P., Rollin, P., Flamand, A. Rabies virulence: effect on pathogenicity and sequence characterization of rabies virus mutations affecting antigenic site III of the glycoprotein. Journal of Virology. 53, 926-934 (1985).
- Lafon, M. Rabies virus receptors. Journal of Neurovirology. 11, 82-87 (2005).
- Benmansour, A., Leblois, H., Coulon, P., Tuffereau, C., Gaudin, Y., Flamand, Y., Lafay, A. Antigenicity of the rabies virus glycoprotein. Journal of Virology. 65, 4198-4203 (1991).
- . . Rabies Vaccine Workshop Summary. , (2011).
- De Mattia, F., et al. The Vaccines Consistency Approach Project: an EPAA initiative. Pharmeuropa Bio & Scientific Notes. 2015, 30-56 (2015).
