تحدث التغيرات المورفولوجية في الخلايا الليفية المتجاوبة المناعية بعد التنشيط وتعزيز التعديلات في التوظيف الخلوي. استخدام التصوير بفوتونين بالاقتران مع بروتين خاص بالفيبلاف 1 (FSP1) من الفوتونات وراثياً؛ tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) خط الماوس والأخضر الفلورسنت الموسومة lipopolysaccharide-FITC، يمكننا أن نوضح استيعاب محددة للغاية من lipopolysaccharide في الخلايا الليفية الجلدية والتغيرات المورفولوجية في الجسم الحي.
الخلايا الليفية هي الخلايا mesenchymal التي تغير مورفولوجيا عند التنشيط، مما يؤثر في نهاية المطاف على البيئة الدقيقة للأنسجة التي تقع فيها. على الرغم من أن تقنيات التصوير التقليدية مفيدة في تحديد تفاعلات البروتين ومورفولوجيا في الأنسجة الثابتة، فإنها ليست قادرة على إعطاء نظرة ثاقبة حول مدى سرعة الخلايا قادرة على ربط وكمية البروتينات، ومرة واحدة تنشيط كيف يتغير مورفولوجيا في فيفو. في هذه الدراسة، ونحن نسأل 2 الأسئلة الرئيسية: 1) ما هو المسار الزمني لتنشيط الخلايا الليفية عن طريق تأثير مثل مستقبلات-4 (TLR4) وتفاعل lipopolysaccharide (LPS) و 2) كيف تتصرف هذه الخلايا مرة واحدة تفعيلها؟ باستخدام التصوير 2-فوتون، قمنا بتطوير تقنية جديدة لتقييم قدرة LPS-FITC لربط مستقبلات الكونات، TLR4، وأعرب عن الخلايا الليفية الطرفية في خط الماوس مراسل الوراثية. FSP1cre; tdTomatolox-stop-lox في الجسم الحي. هذا النهج الفريد يسمح للباحثين لخلق أشرطة الفيديو المتعمقة، الفاصل الزمني و / أو صور من البروتينات التفاعل مع الخلايا الحية التي تسمح للمرء أن يكون مستوى متزايد من الحبيبية في فهم كيف يمكن للبروتينات تغيير السلوك الخلوي.
Lipopolysaccharide (LPS) هو إندوتوكسين موجود في الغشاء الخارجي للبكتيريا سلبية الغرام1. LPS لديه تقارب ملزم عالية لمستقبلات مثل الرسوم 4 (TLR4)/CD14/MD2 مستقبلات مجمع2. TLR4 هو مستقبلات التعرف على نمط وجدت عادة على الغشاء الخارجي لمجموعة واسعة من الخلايا المناعية, الخلايا mesenchymal, ومجموعة فرعية من الخلايا العصبية الحسية3,4,5. يؤدي تنشيط TLR4 المعبر عنه على الخلايا المناعية إلى أنظمة رسول ثانية معتمدة على MyD88 ومستقلة، وتنتهي بنقل بيتا كابا العامل النووي (NFיB) إلى نواة الخلية. وهذا يسبب الخلية المناعية prototypic لإنتاج وإطلاق السيتوكينات المؤيدة للالتهابات مثل إنترلوكين (IL)-1β، IL-6، و TNF-α6. ومع ذلك, كيف تستجيب أنواع الخلايا الأخرى لتحفيز TLR4 ليست واضحة كما. وقد تورطت الخلايا الليفية في مجموعة واسعة من الأمراض مثل السرطان والتليف الكيسي، وقد ثبت مؤخرا أن تلعب دورا monocyte العلاج الكيميائي الجذب وتعزيز التهاب7،8،9. يهتم مختبرنا بدور الخلايا الليفية في تطوير الألم الحاد والمزمن، حيث تشير الأدلة المبكرة إلى أن العوامل التي تطلقها الخلايا الليفية (مصفوفة metalloproteinases (MMPs)، مثبطات الأنسجة من metalloproteinases (TIMPs)، والخلايا الليفية عوامل النمو (FGFs)) تشارك في الألم العصبي10.
يمكن تحديد حالات تنشيط الخلايا من خلال مجموعة متنوعة من العوامل التي تشمل: تحريض الجينات الفورية المبكرة، وتغيير التعبير البروتيني، وانتشار الخلايا، والتغيرات المورفولوجية11،12،13. هناك العديد من التقنيات الموجودة للإجابة على الأسئلة التي قد تكون لدينا حول كيفية تنشيط الخلايا يساهم في الأمراض، ولكن لديهم جميعا قيودها. يستخدم الكيمياء المناعية النمطية الأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية لتسمية البروتينات ذات الأهمية في الأنسجة الثابتة، والتي قد تكون غير محددة وغالبا ما تتطلب استكشاف الأخطاء وإصلاحها كبيرة قبل أن تسفر عن نتائج مثمرة14. النشاف الغربي هو تقنية مفيدة عند مقارنة مستويات التعبير البروتين في أنسجة ما بعد الوفاة. ومع ذلك، فإن العنصر النسيجي يفتقر إلى هذه التقنية والباحثين غير قادرين على تحديد أي تغييرات في مورفولوجيا15. RNA-Seq يسمح لنا لتحديد كمية وجود RNA رسول في عينة التي في كثير من الحالات تسفر عن بيانات ثاقبة. ومع ذلك، فإن الفجوة بين النسخ والترجمة يجعل من الصعب أن يكون القرار الزمني بعد التحفيز16. التصوير البؤري مفيد في تحديد التعبير والتعريب المشترك للبروتينات الموجودة في مقطع عرضي من الأنسجة17. في كثير من الأحيان، وهذا لا يمثل كامل عينة الأنسجة. وعلى النقيض من ذلك، تسمح المجاهر متعددة الفوتونات للمستخدمين بتصوير ما يقرب من 1 مم في عمق العينة، وخلق تمثيل شامل ثلاثي الأبعاد18. لذلك، نختار التركيز على في الجسم الحي، 2-الفوتون التصوير الإعدادية، والبيانات التي تم جمعها من هذه التجارب هي أكثر مباشرة ذات الصلة إلى البيئة الدقيقة البلاستيكية للغاية ومترابطة من الأنسجة الحية.
ميزة دراسة التفاعلات مستقبلات البروتين في الجسم الحي هو أننا يمكن أن التقاط بوضوح كيف تستجيب الخلايا لتحفيز, في الوقت الحقيقي, في بيئتهم الأصلية دون تأثير ضار وغير متوقع لاستخراج الأنسجة بعد الوفاة19. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء دراسات طولية لتقييم اللدونة الخلوية وفتيلة التي قد تحدث بسبب التنشيط. باستخدام التصوير 2-فوتون، ونحن الحفاظ على سلامة البيئة الدقيقة موجودة عند تطبيق التحفيز الخارجي. يوفر هذا البروتوكول طريقة لتحديد الاستفادة من الجزيئات في الخلايا الليفية بعد الحقن المحيطي من LPS الموسومة بشكل فلوري على مدى عدة ساعات في الجسم الحي ودور TLR4 في تنشيط الخلايا الليفية.
يمكن القول أن أهم الخطوات في الجسم الحي 2-فوتون التصوير هي: 1) اختيار الماوس مراسل الوراثية الحق والبروتين الفلورسنت الموسومة لإعداد الفوتون متعددة والاحتياجات التجريبية21،22؛ 2) تصوير المستوى البؤري الصحيح ليكون لها تمثيل دقيق لسكان الخلايا في الأنسجة<sup class=…
The authors have nothing to disclose.
يتم اعتماد هذا العمل بواسطة منحNS096030 (MDB). كما نود أن نشكر مدير التصوير الأساسي فيد براكاش. كما نود أن نشكر مركز أوليمبوس ديسكفري/ مرفق التصوير الأساسي في يو تي دالاس على توفير المعدات والدعم
10x PBS, 4 L | Fisherbrand | BP3994 | |
700 Series MICROLITER Syringes, Hamilton, Model 705 LT Syringe | Hamilton | 80501 | |
BD Precision Glide Needle 30G | VWR | 305106 | |
Blue Pad | Fisherbrand | 1420665 | |
Filter Cube: Green/Red (BP 495-540 DM570 BP 575-645) | Olympus | FV30-FGR | |
Isoflurane, USP 250 mL | Vedco | 50989-150-15 | |
Lipopolysaccharides from Escherichia Coli O111:B4 – FITC conjugate | Sigma-Aldrich | F3665-1MG | |
Main scanner laser: Spectra Physics INSIGHT DS+ -OL pulsed IR LASER, tunable from 680 nm to 1300 nm, 120 fs pulse width at specimen plane | Spectra Physics | ||
Micro Centrifuge Tubes, 1.5 mL | VWR | 20170-333 | |
Multiphoton Microscope: Olympus MPE-RS TWIN | Olympus | MPE-RS TWIN | |
Objective: Ultra 25x MPE water-immersion objective 1.05 NA, 2 mm WD | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
Personal Lubricant Jelly (Gel) | equate | ZH727 2E F1 | |
SGM-4 Stereotaxic Apparatus | Narishige | 16030 | |
SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | SS-01 | |
Stimulation laser: Olympus-specific SPECTRA PHYSICS MAI TAI HP DEEP SEE-OL pulsed IR LASER, tunable from 690 nm to 1040 nm, 100 fs pulse width at specimen plane | Spectra Physics |