介绍了基于PDMS的多层微流体装置的制造过程,该装置允许长时间进行体外转录和翻译(IVTT)反应。此外,还全面概述了自动化和维护这些反应所需的硬件和软件,
随着研究人员致力于开发更大、更复杂的合成遗传调控回路,基于细胞的合成生物学的局限性正变得越来越明显。对体内合成遗传调控网络的分析非常耗时,而且缺乏环境控制,外源合成成分与宿主过程相互作用,导致不良行为。为了克服这些问题,新型电路的无细胞表征正变得越来越普遍。体外转录和翻译(IVTT)混合物允许调节实验环境,并可针对每个独特的系统进行优化。此处介绍的协议详细介绍了多层微流体器件的制造,该装置可用于长时间维持IVTT反应。与批次反应不同,在资源随时间而耗尽和(副产品)产品积累的情况下,微流体装置的使用允许补充资源并去除反应产物。通过这种方式,通过维持一个不平衡的环境来模拟细胞环境,在这种环境中,可以长期研究基因回路的动态行为。为了充分利用多层微流体器件,集成了硬件和软件,使IVTT反应自动化。通过将IVTT反应与此处介绍的微流体平台相结合,可以全面分析复杂的网络行为,从而加深我们对调节细胞过程机制的理解。
细胞能够使用复杂的动态调节网络1,2来感知和响应其环境。合成生物学领域利用我们对包括这些网络的自然存在的成分的知识来设计生物系统,这些生物系统可以扩展细胞3,4的功能。相反,通过设计现有电路的简化合成类似物,或者通过具有自然发生行为的前瞻性工程生物系统,还可以进一步理解管理生命的自然网络。这种生物系统的解构工程以自下而上的方式进行,其中新的基因电路或信号通路以合理的方式设计,使用定义明确的部分5,6。将网络的合理设计与生物相关系统的设计相结合,可以对具有不同抽象层次的生物调控系统进行深入的表征和研究。
Elowitz和Leibler8和Gardner等人9的开创性工作首次证明了合成基因网络在细胞宿主中的成功引入。在接下来的十年里,尽管在细胞7、10、11中引入合成电路方面出现了一些限制,但许多研究人员仍然继续在这些初步成功的基础上再接再厉。 , 12.理想情况下,将合成电路引入蜂窝主机应采用模块化方式。不幸的是,蜂窝环境的复杂性使得这一点特别具有挑战性,许多部分和网络的功能高度依赖于上下文12,13,14。因此,网络经常遇到与本机主机组件的不需要的交互,这可能会影响合成电路的功能。同样,外源网络的组件可以抑制主机进程,在主机内争夺共享资源,并影响增长动力学 15、16、17 。因此,为了合理设计和预测合成网络在体环境中的行为,需要一个综合模型,所有主机和电路特定的动力学。
使用蜂窝主机对合成网络进行表征的一种可行的替代方法是应用体外转录和翻译 (IVTT) 技术。作为合成网络的试验台,反应在包含实现基因表达19、20、21所需的所有成分的溶液中进行。以这种方式,一个生物相关,虽然是人工的环境,其中合成网络可以测试22,23,24,25,26, 27,28.使用IVTT解决方案的一个主要优点是在用户指定的条件下执行反应的能力,研究人员能够调整每个反应的准确组成2。此外,无细胞方法支持合成网络的高通量测试,因为它无需执行耗时的细胞克隆步骤。因此,连续设计-建造-测试周期的持续时间显著缩短29,30,31,32。利用无细胞克隆技术(如吉布森组件)快速设计新型网络,以及利用线性DNA模板构建网络,从而进一步加快设计周期,这与体内测试所需的质粒不同——可通过聚合酶链反应(PCR)33、34进行扩增。
批量反应是执行IVTT反应的最简单方法,需要一个单一反应容器,其中所有反应成分结合35。这种反应足以用于蛋白质表达和基本电路测试,但在试图研究网络的长期动态行为时证明是不够的。在批量反应过程中,试剂要么耗尽,要么降解,导致转录率和转化率持续下降。此外,随着反应的不断进步,副产品会干扰或完全抑制网络的正常运行。最终,使用批量反应器限制了可以观察到的动态行为,而消极的调节对于实施5,36尤其具有挑战性。
IVTT系统的多功能性使多种替代方法可以执行长时间的IVTT反应,从连续流到滴基方法,以及更简单的透析方法2,30,37,38,39,40.微流体器件的应用为用户提供了对反应的增强控制,同时提高了吞吐量,将成本降至最低 35、41、42,每种特定方法都有其自身优势。连续流的使用可以很容易地优化,提高表达产量,然而,无法有效地去除特定的反应产物,使动态行为的研究不平凡39。虽然采用基于液滴的微流体系统允许对新型网络进行高通量筛选,但难以向反应提供新鲜试剂,导致液滴类似于小体积批量反应43。透析基反应器允许引入新的试剂以及去除一些反应产物,然而,RNA分子和较大的蛋白质在反应器内积累,太大,无法扩散到膜孔。此外,需要大量的试剂来维持这些反应的时间为30,44。2013年,Maerkl等人展示了一种多层微流体装置,专门用于进行长时间的IVTT反应36,45。使用多层微流体装置可以直接控制流体流动,允许在设备46、47的特定区域重定向和隔离流体。这些隔离区域可以作为独立的纳米升级反应室,其中IVTT反应可以进行。在单个IVTT反应过程中,使用定期注入新试剂到反应器中补充IVTT成分和DNA模板。同时,将相同体积的旧反应溶液置换,去除反应产物。通过这种方式,保持一个不平衡的环境,使基底转录和翻译速率保持稳定状态,延长IVTT反应的寿命,并允许发生丰富的动态行为。通过应用这种方法,研究人员能够研究特定电路内发生的单个过程的动能速率,从而有助于新基因网络的前瞻性工程。例如,尼德霍尔特迈尔等人用这种方法来描述遗传环振荡器的各种元素,确定其动能速率36。在进一步的研究中,Yelleswarapu等人表明,在批处理条件下确定的西格玛因子28(±28)的动力学速率不足以描述基于±28的振荡器的行为,并且添加基于流量的数据改进了网络行为的模型预测22。
本手稿的目的是为能够执行长期 IVTT 反应的多层微流体器件的制造提供完整的方案。此外,本手稿将描述执行长时间 IVTT 反应所需的所有硬件和软件。微流体装置的驱动 – 控制流体流动所必需的 – 是通过使用一系列气动阀实现的,这些气动阀通过管道长度直接连接到微流体装置。反过来,气动阀通过定制的虚拟控制接口进行控制。微流体装置内的流体流动是使用市售的压力调节系统提供的连续压力实现的。IVTT反应通常在29°C至37°C之间进行,显微镜培养箱用于调节反应过程中的温度。然而,当储存在4°C以上时,IVTT混合物的功能会逐渐退化。因此,本手稿将扩展用于在注入微流体装置之前用于冷却 IVTT 混合物的离片冷却系统。最后,本手稿全面概述了使用微流体流反应器成功执行长期 IVTT 反应所需的程序,以便其他研究人员能够相对地复制该技术缓解。
介绍了一种基于PDMS的多层微流体装置,并证明了其长期维持IVTT反应的能力。尽管该技术非常适合此特定示例,但可以想象,该技术可用于许多其他应用。对流体流动的额外控制 – 与持续补充反应试剂,同时去除(按)产品的能力 – 是连续合成反应、调查各种动态行为和同时单一反应的多种变异的传导。
尽管基于 PDMS 的设备的制造过程相对简单,但使用它需要大量的硬件设置。包括阀门阵列、压力调节器、压力泵、孵化器和冷却单元,从制造到使用的过渡不是基本阶段,需要大量的初始投资。此外,能否持续设置和成功使用这些器件进行实验,需要大量的时间投入;本手稿旨在解决的一点。但是,一旦就位,整个设置可以修改为一系列的目的。此外,硬件设置包括许多模块化元件,每个模块都可以扩展,以便采用更复杂的微流体器件设计。此外,模块化设计允许通过功能类似的替代方案替换硬件组件,这样用户不仅限于此处描述的特定设置48,49。
单个设备之间以及外部条件(如压力波动)中的可变性可能导致使用这些设备执行实验时不准确。为了解决这个问题,应在每次实验之前对系统进行校准,为每个反应器提供唯一的刷新率。虽然校准解决了设备到设备以及实验到实验的变化,但它是一个耗时的过程,并非完美无缺。当暴露于相同的压力时,粘度不同的流体不会以相同的速率流动,因此使用多个试剂进行校准可能不会产生相同的刷新率。通过使用三个控制通道将试剂蠕动泵入微流体装置,而不是仅通过改变提供的压力来调节流量,可以减轻这种效应。在粘度差异非常大的情况下,作为最后手段,可以通过执行多个校准实验,为每个试剂实现独特的刷新率。
使用蠕动泵将试剂注入微流体装置,会削弱使用粘度不同的溶液的影响,但它也造成了次要问题。使用离散步骤将流体泵入微流体装置,意味着注入到单个反应器的分辨率受执行单个泵循环时注入的体积的限制。在我们的研究中,这个值(在校准期间确定)大约等于1%,表明单个泵循环会取代大约1%的反应堆体积(约0.1 nL)。因此,取代30%的反应堆体积需要执行30个泵循环,23个泵周期的IVTT反应溶液被添加,只有7个泵周期的DNA或超纯水被添加。虽然我们的研究已经足够了,但当尝试添加大量独特的试剂、使用较低的刷新分数或向反应器中添加更小的单个试剂体积时,其他实验协议可能会遇到问题。在这种情况下,微流体装置设计可以调整,以提供更大的体积反应器。尼德霍尔特迈尔等人36日报道了这一例子。
至关重要的是,本手稿中概述的装置允许反应持续很长时间,从而产生稳态转录和翻译率。通过定期将新试剂注入反应器,并去除反应(按产品),反应是持续的,可以监测复杂的动态行为。通过这种方式,创建了一个平台,在一定程度上模仿了蜂窝环境。此外,该平台通过调整注射之间的周期和喷射的具体组成,能够探索系统动力学。因此,这些多层微流体器件是显示复杂动态行为的新型合成网络的特征和优化的有力工具。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了欧洲研究理事会、ERC(BioCircuit项目)的支持,这是荷兰科学研究组织提供的NWO-VIDI赠款(NWO,723.016.003),来自教育、文化和科学部的资助(Gravity计划, 024.001.035 和 024.003.013), 人类前沿科学计划资助 RGP0032/2015, 欧盟 Horizon 2020 研究和创新计划下的欧洲研究理事会 资助 723106, 以及瑞士国家科学基金会赠款200021_182019.
Reagents | |||
Acetone | VWR | 20063.365 | |
AZ 40 XT | Merck KGaA (Darmstadt, Germany) | – | Positive Photoresist |
AZ 726 MIF Developer | Merck KGaA (Darmstadt, Germany) | – | Developer Positive Photoresist |
Isopropanol | Merck KGaA (Darmstadt, Germany) | 109634 | |
Microscope slides | VWR | ECN 631-1550 | |
mr Dev 600 | Microresist Technology GmbH (Berlin, Germany) | – | Developer Negative Photoresist |
Silicon Free Heat Sink Grease | Circuit Works | CW7270 | Thermal Compound |
Silicon wafers | Silicon Materials | – | <1-0-0> orientation, 100 mm diameter, 525 µm thickness |
SU-8 3050 | Microchem Corp. (Newton, MA) | – | Negative Photoresist |
Sylgard 184 Elastomer Kit (PDMS) | The Dow Chemical Company | 01317318 | |
trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
4 channel digital input/output module | WAGO Kontakttechnik GmbH | 750-504 | 8x |
Camera lens | The Imaging Source | – | |
Compression fitting | Koolance, Inc. | FIT-V06X10 | Fitting for tubing with 6mm ID and 10mm OD. 4x |
Controller end module | WAGO Kontakttechnik GmbH | 750-600 | |
Device connecting tubing | Saint-Gobain Performance Plastics | AAD04103 | 0.02" ID, 0.06" OD, Tygon Tubing (ND-100-80) |
Device connector pins | Unimed SA (Lausanne, Switserland) | 200.010-A | AISI 304 tubing, 0.35mm ID, 0.65mm OD, 8mm L |
Ethernet Controller | WAGO Kontakttechnik GmbH | 750-881 | |
Female bus connector | Encitech | DTCK15-DBS-K | 15 pole female bus connector |
Fluid reservoirs | Fluigent | Fluiwell-4C | |
Fluigent pressure system | Fluigent | MFCS-EZ | 0 – 345 mbar |
Hg short arc lamp | Advanced Radiation Corporation | – | 350W |
Hot plate | Torrey Pines Scientific | HP61 | |
Inverted microscope | Nikon Instruments | Eclipse Ti-E | |
LabVIEW Software | de Greef Lab, Eindhoven University of Technology | https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software | |
Liquid coolant | Koolance, Inc. | LIQ-705CL-B | |
Luer stubs | Instech Laboratories, Inc. | LS23 | |
Male Luer to barb connectors | Cole Parmer | 45505-32 | 3/32" ID |
Matlab Software | de Greef Lab, Eindhoven University of Technology | https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software | |
Microcamera | The Imaging Source | DMK 42AUC03 | |
Microscope camera | Hamamatsu Photonics | OrcaFlash4.0 V2 (C11440-22CU) | |
Orbital shaker | Cole Parmer | EW-513000-05 | |
Oven | Thermo Scientific | Heraeus T6P 50045757 | |
Oxygen plasma asher | Quorum Technologies | K1050X | |
PDMS puncher | SYNEO | Accu-Pucnh MP10 | |
PEEK tubing | Trajan | 1301005001-5F | 0.005" ID, 1/32" OD, Red |
Peltier element | European Thermodynamics | APH-127-10-25-S | |
Peltier temperature controller | Warner Instruments | CL-100 | |
Photomask | CAD/Art Services, Inc. | – | |
Photomask Design | Maerkl Lab, EPFL | https://zenodo.org/record/886937#.XBzpA8-2nOQ | |
Pneumatic valve array | FESTO | – | 1x 22 valve array and 1x 8 valve array, Normally closed valves. |
Power adapter | Koolance, Inc. | ADT-EX004S | 110/220V AC Power Adapter |
PTFE tubing | Cole Parmer | 06417-21 | #24 AWG Thin Wall PTFE |
Punching pin | SYNEO | CR0320245N21R4 | OD: 0.032" (0.8128 mm), ID: 0.024" (0.6090 mm) |
PVC Tubing | Koolance, Inc. | HOS-06CL | 6 mm ID, 10 mm OD |
Single edge blades | GEM Scientific | – | |
Soft tubing | Fluigent | – | Supplied with fluid reservoirs. (1 mm ID, 3mm OD) |
Spin coater | Laurell Technologies Corporation | WS-650MZ-23NPPB | |
Stereo microscope | Olympus Corporation | SZ61 | |
Thermistor cable | Warner Instruments | TA-29 | Cable with bead thermistor |
UV exposure system | ABM, USA | – | Near UV Exposure System, 350W |
Vacuum pump | Vacuumbrand GmbH | MD1C | |
Water cooled cold plate block | Koolance, Inc. | PLT-UN40F | |
Water cooler | Koolance, Inc. | EX2-755 | |
Weighing scales | Sartorius | M-prove |