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遗传学

Estudo funcional in vivo de variantes humanas raras associadas à doença usando Drosophila

Published: August 20, 2019
doi:
10.3791/59658
, , , ,
1Department of Molecular and Human Genetics,Baylor College of Medicine, 2Program in Developmental Biology,Baylor College of Medicine, 3Department of Pediatrics, Section of Neurology and Developmental Neuroscience,Baylor College of Medicine, 4Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute,Texas Children’s Hospital, 5Department of Neuroscience,Baylor College of Medicine

Summary

O objetivo deste protocolo é delinear o desenho e o desempenho de experimentos in vivo em Drosophila melanogaster para avaliar as conseqüências funcionais de variantes genéticas raras associadas a doenças humanas.

Abstract

Os avanços na tecnologia de sequenciamento tornaram os conjuntos de dados de todo o genoma e todo-exome mais acessíveis tanto para o diagnóstico clínico quanto para a pesquisa genética humana de ponta. Embora vários algoritmos de silico tenham sido desenvolvidos para prever a patogenicidade das variantes identificadas nesses conjuntos de dados, os estudos funcionais são fundamentais para determinar como as variantes genômica específicas afetam a função protéica, especialmente para o missense Variantes. Na rede de doenças não diagnosticadas (UDN) e outros consórcios de pesquisa de doenças raras, os organismos modelo (MO), incluindo a Drosophila, C. elegans, zebrafish e camundongos, são usados ativamente para avaliar a função da doença putativa humana-causando Variantes. Este protocolo descreve um método para a avaliação funcional de variações humanas raras usadas no núcleo da Drosophila do centro de seleção dos organismos modelo do UDN. O fluxo de trabalho começa com a coleta de informações humanas e de MO de vários bancos de dados públicos, usando o recurso da Web MARRVEL para avaliar se a variante é susceptível de contribuir para a condição de um paciente, bem como projetar experimentos eficazes com base em disponíveis conhecimento e recursos. Em seguida, são geradas ferramentas genéticas (por exemplo, linhas T2A-GAL4 e UAS-Human cDNA) para avaliar as funções de variantes de interesse na Drosophila. Em cima do desenvolvimento destes reagentes, os ensaios funcionais Two-pronged baseados em experimentos do salvamento e da superexpressão podem ser executados para avaliar a função variante. No ramo de resgate, os genes de mosca endógena são “humanizados” substituindo o gene da Drosophila ortologosa por transgenes humanos de referência ou variante. No ramo de superexpressão, as proteínas humanas de referência e variante são conduzidas exogenamente em uma variedade de tecidos. Em ambos os casos, todo o phenotype pontuáveis (por exemplo, letalidade, morfologia do olho, electrophysiology) pode ser usado como uma leitura-para fora, independentemente da doença do interesse. As diferenças observadas entre os alelos de referência e variantes sugerem um efeito variante-específico e, portanto, provável patogenicidade. Este protocolo permite avaliações rápidas, in vivo, de variantes de genes causadores de doenças humanas putativas com funções conhecidas e desconhecidas.

Introduction

Pacientes com doenças raras muitas vezes passam por uma árdua jornada referida como a “Odisseia diagnóstica” para obter um diagnóstico preciso1. A maioria de doenças raras são pensados para ter uma origem genética forte, fazendo análises genéticas/genomic elementos críticos do workup clínico. Além do que o seqüenciamento do painel do gene do candidato e a análise da variação do número da cópia baseadas em Microarrays cromossomáticos, as tecnologias Whole-exome (WES) e do inteiro-genoma que sequenciam (WGS) tornaram-se ferramentas cada vez mais valiosas sobre a década passada2, a 3. Atualmente, a taxa diagnóstica para identificar uma variante patogênica conhecida em Wes e WGS é de ~ 25% (maior em casos pediátricos)4,5. Para a maioria de casos que permanecem undiagnosed após WES/WGS clínico, uma edição comum é que há muitos genes e variants do candidato. O sequenciamento da próxima geração geralmente identifica variantes novas ou ultramodernas em muitos genes, e interpretar se essas variantes contribuem para fenótipos de doença é desafiador. Por exemplo, embora a maioria de mutações do absurdo ou do Frameshift nos genes sejam pensadas para ser perda–função (LOF) alelos devido à deterioração absurdo-negociada da transcrição codificada, as mutações truncando encontradas nos últimos exons escapam este processo e podem funcionar como alelos benignos ou de ganho de função (GOF)6.

Além disso, prever os efeitos de um alelo missense é uma tarefa assustadora, uma vez que pode resultar em um número de diferentes cenários genéticos como descrito pela primeira vez por Herman Muller na década de 1930 (ou seja, amorfo, hipomorfo, hipermorfo, antimorfo, neomorfo, ou isomorph)7 . Numerosos em programas de silico e metodologias foram desenvolvidos para prever a patogenicidade de variantes missense com base na conservação evolutiva, tipo de mudança de aminoácidos, posição dentro de um domínio funcional, alelo freqüência na população geral, e outros parâmetros8. No entanto, esses programas não são uma solução abrangente para resolver o problema complicado de interpretação variante. Curiosamente, um estudo recente demonstrou que cinco algoritmos de predição de patogenicidade variante amplamente utilizados (PolyPhen9, Sift10, CADD11, provean12, provador de mutação) concordam com a patogenicidade ~ 80% do tempo8 . Notavelmente, mesmo quando todos os algoritmos concordam, eles retornam uma predição incorreta de patogenicidade até 11% do tempo. Isto conduz não somente à interpretação clínica defeituada mas igualmente pode dissuadir investigadores de seguir acima em variants novos falsamente alistando os como benignos. Uma forma de complementar a atual limitação da modelagem em silico é fornecer dados experimentais que demonstre o efeito da função variante in vitro, ex vivo (por exemplo, células cultivadas, organóides) ou in vivo.

Estudos funcionais in vivo de variantes associadas a doenças raras em MO têm pontos fortes únicos13 e foram adotados por muitas iniciativas de pesquisa de doenças raras em todo o mundo, incluindo a rede de doenças não diagnosticadas (UDN) nos Estados Unidos e Rare Modelos de doenças & mecanismos (RDMM) redes no Canadá, Japão, Europa e Austrália14. Além desses esforços coordenados para integrar pesquisadores de MO no fluxo de trabalho de diagnóstico de doenças raras e estudos mecanísticos em escala nacional, vários estudos colaborativos individuais entre pesquisadores clínicos e de MO levaram à descoberta e caracterização de muitos novos genes causadores de doenças humanas e variantes82,83,84.

Na UDN, um centro de triagem de organismos modelo centralizado (MOSC) recebe submissões de genes candidatos e variantes com uma descrição da condição do paciente e avalia se a variante é susceptível de ser patogênica usando ferramentas de informática e in vivo Experiências. Na fase I (2015-2018) da UDN, o MOSC é composto por um núcleo de Drosophila [Baylor College of Medicine (BCM)] e zebrafish Core (Universidade do Oregon) que trabalharam colaborativamente para avaliar os casos. Usando a análise informática e um número de estratégias experimentais diferentes na Drosophila e no zebrafish, o Mosc contribuiu até agora ao diagnóstico de 132 pacientes, identificação de 31 síndromes novas55, descoberta de diversos seres humanos novos genes da doença (por exemplo, EBF315, ATP5F1D16, TBX217, IRF2BPL18, COG419, WDR3720) e expansão fenotípica da doença conhecida genes (por exemplo, CACNA1A,21ACOX122).

Além de projetos dentro da UDN, os pesquisadores do núcleo de Drosophila da Mosc contribuíram para novas descobertas genéticas de doenças em colaboração com os centros de genômica mendeliana e outras iniciativas (por exemplo, ANKLE2,23, TM2D3 24, NRD125, OGDHL25, ATAD3A26, ARIH127, MARK328, dnmbp29) usando o mesmo conjunto de informática e genética estratégias desenvolvidas para a UDN. Dado o significado de estudos do MO no diagnóstico raro da doença, o MOSC foi expandido para incluir um núcleo de C. elegans e o segundo núcleo de zebrafish (ambos na Universidade de Washington em St. Louis) para a fase II (2018-2022) do UDN.

Este manuscrito descreve um protocolo de estudo funcional in vivo que é usado ativamente no núcleo de Drosophila da UDN Mosc para determinar se as variantes de missense têm conseqüências funcionais sobre a proteína de interesse usando moscas transgênicas que expressam Proteínas. O objetivo deste protocolo é ajudar os pesquisadores de MO a trabalharem colaborativamente com grupos de pesquisa clínica para fornecer evidências experimentais de que uma variante candidata em um gene de interesse tem conseqüências funcionais, facilitando assim o diagnóstico clínico. Este protocolo é o mais útil em um Scenario em que um investigador da Drosophila é aproximado por um investigador clínico que tenha um paciente raro da doença com uma variação específica do candidato em um gene do interesse.

Este protocolo pode ser dividido em três elementos: (1) coletar informações para avaliar a probabilidade de a variante de interesse ser responsável pelo fenótipo do paciente e a viabilidade de um estudo funcional em Drosophila, (2) coleta instrumentos genéticos existentes e estabelecer novos, e (3) realizar estudos funcionais in vivo. O terceiro elemento pode ser subdividido em dois subelementos com base em como a função de uma variante de interesse pode ser avaliada (experimento de resgate ou estratégias baseadas em superexpressão). É importante notar que este protocolo pode ser adaptado e otimizado para muitos cenários fora da rara pesquisa de doença monogênica (por exemplo, doenças comuns, interações gene-ambiente e telas farmacológicas/genéticas para identificar alvos terapêuticos). A capacidade de determinar a funcionalidade e a patogenicidade das variantes não só beneficiará o paciente de interesse, fornecendo um diagnóstico molecular preciso, mas também terá impactos mais amplos na pesquisa científica translacional e básica.

Protocol

1. coleta de informações humanas e MO para avaliar: probabilidade de uma variante de interesse ser responsável por fenótipos de doenças e viabilidade de estudos funcionais em Drosophila Realize pesquisas extensas de banco de dados e literatura para determinar se os genes e variantes de interesse específicos são bons candidatos para explicar o fenótipo do paciente de interesse. Especificamente, reúna as seguintes informações. Avalie se o gene do interesse estêve im…

Representative Results

Estudo funcional de de novo variante missense em EBF3 ligado a fenótipos de neurodesenvolvimentoEm um macho dos anos de idade 7 com os fenótipos do neurodesenvolvimento que incluem a hipotonia, a ataxia, o atraso desenvolvente global, e a desordem de discurso expressivo, os médicos e os geneticistas humanos nos institutos nacionais da saúde projeto das doenças undiagnosed (UDP) identificou uma variante de missense de novo (p. R163Q) em EBF3 (Early b-Cell factor 3)<sup …

Discussion

Estudos experimentais utilizando Drosophila melanogaster proporcionam um sistema de ensaio robusto para avaliar as consequências das variantes humanas associadas à doença. Isto é devido ao grande corpo do conhecimento e das ferramentas genéticas diversas que foram geradas por muitos investigadores no campo da mosca sobre o século passado89. Assim como qualquer outro sistema experimental, no entanto, é importante reconhecer as advertências e limitações que existem.

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Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a José Salazar, Julia Wang e a Dra Karen Schulze pela leitura crítica do manuscrito. Reconhecemos os Drs. Ning Liu e XI Luo para a caracterização funcional das variantes TBX2 discutidas aqui. O centro de triagem de organismos do modelo de rede de doenças não diagnosticadas foi apoiado pelo fundo comum dos institutos nacionais de saúde (NIH) (U54 NS093793). H. T. C. foi apoiado ainda pelo NIH [CNCDP-K12 e NINDS (1K12 NS098482)], Academy americano do Neurology (concessão da pesquisa do Neuroscience), fundo do Wellcome de Burroughs (concessão da carreira para cientistas médicos), sociedade da neurologia da criança e Fundação da neurologia da criança ( PERF Elterman), e o prêmio de independência antecipada do diretor da NIH (DP5 OD026426). M. F. W. foi apoiado pela Simons Foundation (SFARI Award: 368479). S. Y. foi apoiado pela NIH (R01 DC014932), a Fundação Simons (SFARI Award: 368479), a associação de Alzheimer (novo investigador Research Grant: 15-364099), naman família fundo para a investigação básica, e Caroline Wiess lei fundo para a investigação em Medicina molecular. A microscopia confocal em BCM é apoiada na parte por NIH Grant U54HD083092 ao núcleo do Neurovisualization do centro de pesquisa das inabilidades intelectuais e desenvolventes (IDDRC).

Materials

Drosophila Stocks for UAS-human cDNA transgenesis
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24871 Specific Reagent: VK33 (3rd chromosome) Injection line
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24872 Specific Reagent: VK37 (2nd chromosome) Injection line
Plasmid DNA
Cloning vector Thermo Fisher #12536-017 Specific Reagent: pDONR221
Drosophila transgenesis vector Gift from Drs. Johannes Bischof and Konrad Basler (Bischof et al., 2013 PNAS) Specific Reagent: pGW-HA.attB
Molecular biology kits and reagents
Agarose Sigma-Aldrich #A2790 Specific Reagent: Agarose (molecular biology grade)
Chemically Competent Cells (E. coli) Thermo Fisher #18265017 Specific Reagent: DH5α
DNA Gel Extraction kit Thermo Fisher #K210012 Specific Reagent: PureLink Gel Extraction Kit
DNA Isolation and purification kit Qiagen #27104 Specific Reagent: QIAprep Spin Miniprep Kit
High Fidelity Polymerase NEB #M0491 Specific Reagent: Q5 Polymerase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11789020 Specific Reagent: Gateway BP Clonase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11791100 Specific Reagent: Gateway LR Clonase II Enzyme kit
Site Directed Mutagenesis kit Agilent #200523 Specific Reagent: Quick Change II Mutagenesis kit
Electroretinogram Rig related equipment
ERG Analysis Molecular Devices N/A Specific Reagent: Axon pCLAMP 10 Data Software Package
ERG Data Collection LabX #R150358 Specific Reagent: ISO-DAM Isolated Biologic Amplifier
ERG Stimulator Astro-Med #S48 Specific Reagent: Square Pulse Stimulator
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Harnish, J. M., Deal, S. L., Chao, H., Wangler, M. F., Yamamoto, S. In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila. J. Vis. Exp. (150), e59658, doi:10.3791/59658 (2019).
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