Mitochondriën en Endoplasmisch reticulum beeldvorming door Correlatief licht en volume elektronenmicroscopie

Summary

We presenteren een protocol voor het bestuderen van de verdeling van mitochondriën en endoplasmisch reticulum in hele cellen na genetische modificatie met behulp van correlatief licht en volume elektronenmicroscopie met inbegrip van ascorbaat peroxidase 2 en mierikswortelperoxidase kleuring, serie snijden van cellen met en zonder het doel gen in dezelfde sectie, en seriële beeldvorming via elektronenmicroscopie.

Abstract

Cellulaire organellen, zoals mitochondriën en endoplasmisch reticulum (ER), maken een netwerk om een verscheidenheid van functies uit te voeren. Deze sterk gebogen structuren worden in verschillende vormen gevouwen om een dynamisch netwerk te vormen, afhankelijk van de cellulaire omstandigheden. Visualisatie van dit netwerk tussen mitochondriën en ER is geprobeerd met behulp van super-resolutie fluorescentie Imaging en lichte microscopie; echter, de beperkte resolutie is onvoldoende om te observeren van de membranen tussen de mitochondriën en ER in detail. Transmissie elektronenmicroscopie zorgt voor een goede membraan contrast en nanometer-schaal resolutie voor de waarneming van cellulaire organellen; het is echter uitzonderlijk tijdrovend bij het beoordelen van de driedimensionale (3D) structuur van sterk gebogen organellen. Daarom observeerden we de morfologie van mitochondriën en ER via correlatieve licht-elektronenmicroscopie (CLEM) en volume-elektronenmicroscopie technieken met behulp van verbeterde ascorbaat peroxidase 2 en mierikswortelperoxidase kleuring. Een en bloc-kleurings methode, ultradunne seriële snede (array tomografie) en volume-elektronenmicroscopie werden toegepast om de 3D-structuur te observeren. In dit protocol, we suggereren een combinatie van CLEM en 3D elektronenmicroscopie gedetailleerde structurele studies van mitochondriën en ER uit te voeren.

Introduction

Mitochondriën en endoplasmisch reticulum (ER) zijn membranen gebonden cellulaire organellen. Hun verbinding is noodzakelijk voor hun functie, en eiwitten met betrekking tot hun netwerk zijn beschreven¹. De afstand tussen de mitochondriën en ER is gerapporteerd als ongeveer 100 nm met behulp van Lichtmicroscopie²; echter, recente super-resolution microscopie³ en elektronenmicroscopie (em)⁴ studies hebben aangetoond dat het aanzienlijk kleiner, bij ongeveer 10-25 nm. De resolutie die is bereikt in superresolutie microscopie is lager dan EM, en specifieke labeling is noodzakelijk. EM is een geschikte techniek om een voldoende hoge-resolutie contrast te bereiken voor structurele studies van de verbindingen tussen mitochondriën en ER. Een nadeel is echter de beperkte z-as-informatie, omdat de dunne delen ongeveer 60 Nm of dunner moeten zijn voor conventionele transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). Voor voldoende EM-z-asbeeldvorming kan drie-dimensionale elektronenmicroscopie (3DEM) worden gebruikt⁵. Dit impliceert echter de voorbereiding van honderden dunne seriële secties van hele cellen, wat erg lastig werk is dat slechts een paar bekwame technologen onder de knie hebben. Deze dunne delen worden verzameld op fragiele formvar filmomhulde One-hole TEM roosters. Als de film breekt op één gird, is seriële beeldvorming en volume reconstructie niet mogelijk. Serie Block-face scanning electron microscopie (sbem) is een populaire techniek voor 3dem die gebruik maakt van destructief en bloc snijden in de Scanning Electron Microscoop (SEM) vacuümkamer met ofwel een diamantmes (dik-sbem) of een gerichte ionen straal (FIB-SEM) ⁶. omdat deze technieken echter niet beschikbaar zijn op alle faciliteiten, raden we array computertomografie⁷ aan met behulp van Serial snij en SEM. In array tomografie worden seriële secties die met behulp van een ultramicrotome worden afgesneden, overgebracht naar een glazen afdekplaat in plaats van een TEM-raster en gevisualiseerd via Lichtmicroscopie en SEM⁸. Om het signaal voorbeeld vorming met Backscatter Electron (BSE) te verbeteren, gebruikten we een en bloc EM-kleurings protocol met osmium tetroxide (OsO₄)-vaste cellen met osmiofiele thiocarbohydrazide (tch)⁹, waardoor we beelden kunnen verkrijgen zonder dubbele kleuring na inbedding.

Bovendien, de mitochondriale marker SCO1 (cytochroom c oxidase assembly eiwit 1) – ascorbaat peroxidase 2 (APEX2)¹⁰ moleculaire tag werd gebruikt om te visualiseren van mitochondriën op het em-niveau. APEX2 is ongeveer 28 kDa en is afgeleid van soja ascorbaat peroxidase¹¹. Het werd ontwikkeld om de gedetailleerde locatie van specifieke eiwitten op het EM-niveau te tonen, op dezelfde manier dat groen fluorescerend eiwit-gelabeld eiwit wordt gebruikt in lichte microscopie. APEX2 zet 3, 3 ‘-diaminobenzidine (DAB) om in een onoplosbaar osmiofiele polymeer op de plaats van de tag in aanwezigheid van de cofactor waterstofperoxide (H₂O₂). APEX2 kan worden gebruikt als alternatief voor traditionele antilichaam etikettering in EM, met een eiwit lokalisatie door de gehele diepte van de hele cel. Met andere woorden, het APEX2-Tagged eiwit kan worden gevisualiseerd door specifieke osmication¹¹ zonder immunogold labeling en permeabilization na Ultra-cryosnijden. Mierikswortelperoxidase (HRP) is ook een gevoelige tag die de H₂O₂-afhankelijke polymerisatie van DAB in een gelokaliseerd precipitaat KATALYSEERT, waardoor em-contrast wordt gegeven na behandeling met OsO₄. De ER-doel peptide sequentie HRP-KDEL (Lys-ASP-glu-Leu)¹² werd toegepast om er binnen een hele cel te visualiseren. Om ons protocol te evalueren van het gebruik van genetische Tags en en bloc-kleuring met gereduceerde osmium en TCH (rOTO-methode), met behulp van het osmication-effect op hetzelfde moment, vergeleken we het membraan contrast met en zonder het gebruik van elk genetisch label in rOTO en bloc-kleuring. Hoewel 3dem met array computertomografie en DAB-kleuring met Apex en HRP respectievelijk zijn gebruikt voor andere doeleinden, is ons protocol uniek omdat we array computertomografie hebben gecombineerd voor 3dem en DAB-kleuring voor mitochondriën en er-labeling. Concreet toonden we vijf cellen met en zonder APEX-Tagged genen in dezelfde sectie, die hielp bij het onderzoeken van het effect van de genetische modificatie op cellen.

Protocol

1. celcultuur met patroon raster cultuur schotel en celtransfectie met SCO1-APEX2 en HRP-KDEL plasmide vector Zaad 1 x 105 HEK293T cellen door ze in 35-mm glazen rooster bodem cultuur gerechten te plaatsen in een bevoficeerde atmosfeer met 5% Co2 bij 37 °C in Dulbecco’s gemodificeerde EAGLE’S medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum, 100 U/ml penicillaire, en 100 U/mL streptomycine. De dag na het zaaien van de cellen, wanneer ze zijn gegroeid tot 50%-60% confluency, i…

Representative Results

In Figuur 1 wordt het schema en de werkstroom voor dit protocol beschreven. Het protocol vereist 7 dagen; afhankelijk van de tijd die is besteed aan SEM-beeldvorming, kan dit echter toenemen. Voor de celtransfectie moet de confluentie van de cellen zodanig worden geregeld dat de bodem van de gehele rooster plaat niet wordt Bedek (Figuur 1a). Een hoge celdichtheid kan de identificatie van de cel van belang tijdens lichte Microscoop en EM-observatie voorkomen. We gebruikten genetisch gelab…

Discussion

Het bepalen van de cellulaire lokalisatie van specifieke eiwitten bij een nanometer-resolutie met EM is cruciaal om de cellulaire functies van eiwitten te begrijpen. Over het algemeen zijn er twee technieken om de lokalisatie van een doel proteïne via EM te bestuderen. Een daarvan is de immunogold-techniek, die sinds 1960 in EM is gebruikt, en de andere is een techniek die recent ontwikkelde genetisch gecodeerde tags¹⁶bevat. Traditionele immunogold-technieken hebben antilichamen geconjugeerde gou…

Materials

Glutaraldehyde	EMS	16200	Use only in fume hood
Paraformaldehyde	EMS	19210	Use only in fume hood
Sodium cacodylate	EMS	12300
Osmium tetroxide 4 % aqueous solution	EMS	16320	Use only in fume hood
Epon 812	EMS	14120	EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 – 0.8 ml
Ultra-microtome Leica ARTOS 3D	Leica	ARTOS 3D
Uranyl acetate	EMS	22400	Hazardous chemical
Lead citrate	EMS	17900
35mm Gridded coverslip dish	Mattek	P35G-1.5-14-CGRD
Glow discharger	Pelco	easiGlow
Formvar carbon coated Copper Grid	Ted Pella	01805-F
Hydrochloric acid	SIGMA	258148
Fugene HD	Promega	E2311
Glycine	SIGMA	G8898
3,3′ -diaminobenzamidine (DAB)	SIGMA	D8001	Hazardous chemical
30% Hydrogen peroxide solution	Merck	107210
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate	SIGMA	P3289
0.22 um syringe filter	Sartorius	16534
Thiocarbonyldihydrazide	SIGMA	223220	Use only in fume hood
Potassium hydroxide	Fluka	10193426
L-aspartic acid	SIGMA	A9256
Ethanol	Merck	100983
Transmission electron microscopy	FEI	Tecnai G2
Indium tin oxide (ITO) coated glass coverslips	SPI	06489-AB	fragil glass
Isopropanol	Fisher Bioreagents	BP2618-1
Diamond knife	Leica	AT-4
Inveted light microscopy	Nikon	ECLipse TS100
Scanning electron microscopy	Zeiss	Auriga