تنقيه الصفائح الدموية من الدم الفار
Summary
هنا ، تم جمع دم الفار في وجود مضاد للتخثر. تم تنقيه الصفائح الدموية من قبل التدرج iohexol المتوسطة باستخدام طرد السرعة المنخفضة. الصفائح الدموية تم تفعيلها مع الفحص للتحقيق إذا كانت قابله للحياة تم تحليل نوعيه الصفائح الدموية المنقية من خلال تدفق الخلوي والمجهر.
Abstract
يتم تنقيه الصفائح الدموية من الدم كله لدراسة خصائصها الوظيفية ، والتي ينبغي ان تكون خاليه من خلايا الدم الحمراء (ار بي سي) ، وخلايا الدم البيضاء (مكافحه الحرائق) ، وبروتينات البلازما. ونحن وصف هنا تنقيه الصفائح الدموية من الدم الفار باستخدام ثلاثه اضعاف أكثر iohexol التدرج المتوسط نسبه إلى حجم عينه الدم وطرد في دوار دلو يتارجح في 400 x g لمده 20 دقيقه في 20 ° c. وكان الانتعاش/الغلة من الصفائح الدموية المنقية 18.2-38.5 ٪ ، والصفائح الدموية المنقية كانت في حاله راحة ، والتي لم تحتوي علي اي عدد كبير من ار بي سي ومكافحه الحرائق. وأظهرت الصفائح الدموية المنقية المعالجة مع القدرة علي التنشيط بنسبه 93% ، مما يشير إلى جدواها. وأكدنا ان الصفائح الدموية المنقية نقيه بما فيه الكفاية باستخدام تدفق الخلوي والتقييم المجهري. يمكن استخدام هذه الصفائح الدموية للتعبير عن الجينات ، والتنشيط ، والإفراج عن الحبيبية ، والتجميع ، واختبارات التصاق. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتنقيه الصفائح الدموية من الدم من الأنواع الأخرى ، وكذلك.
Introduction
الصفائح الدموية هي أحد مكونات الدم التي تعمل كبادئ لتخثر الدم ردا علي الضرر في الاوعيه الدموية. انهم يتجمعون في موقع الاصابه لسد جدار السفينة1. الصفائح الدموية هي أجزاء من الخلايا الخلوية المشتقة من البويضات الضخمة لنخاع العظم تحت تاثير الجلطات وتدخل الدورة الدموية2. وتعتبر انها نشطه ايضيه وقادره علي استشعار البيئة خارج الخلية عن طريق تنشيط السلاسل الترددية الإشارات داخل الخلايا التي تؤدي إلى انتشار الصفائح الدموية ، والتراكم ، والأرقاء تشكيل المكونات1،3. إلى جانب الأرقاء/تخثر والتئام الجروح4, الصفائح الدموية تلعب دورا هاما في الاستجاباتالتهابيه المضيف, تولد الاوعيه, و ميتاستاتيس3,5,6,7, 8-الآن
يتم تنقيه الصفائح الدموية من الدم لدراسة خصائصها البيوكيميائية والفسيولوجية ، والتي ينبغي ان تكون خاليه من مكونات الدم الأخرى. منذ خلايا الدم الحمراء (ار بي سي) وخلايا الدم البيضاء (الكريات الحمر) تحتوي علي أكثر بكثير من الحمض الريبي النيبالي والبروتينات من الصفائح الدموية9,10, وجود حتى عدد قليل من هذه الخلايا يمكن ان تتداخل مع التحليلات الناسخة والبروتينية من rna والبروتينات المشتقة من الصفائح الدموية. وجدنا ان الصفائح الدموية المنقية المنشطة مع الأجسام المضادة الربط ، مثل مكافحه GPIIb/IIIa (جون/ا) ومكافحه P-سيلكتين أكثر كفاءه من الصفائح الدموية الكاملة.
وبما ان الصفائح الدموية هشه ، فمن المهم معالجه العينات بأقل ما يمكن. إذا تم تنشيط الصفائح الدموية ، فانها تطلق محتوياتها الحبيبية وتتحلل في نهاية المطاف. لذلك ، للحفاظ علي خصائص الصفائح الدموية الوظيفية سليمه ، من المهم الحفاظ علي الصفيحات الدموية اثناء العزلة. وقد وصفت عده بروتوكولات عزل الصفائح الدموية من الإنسان, الكلبة, الفئران, والرئيسيات غير البشرية بطرق مختلفه1,10,11,12. بعض الطرق تتطلب خطوات متعددة مثل جمع البلازما الغنية بالصفائح الدموية عن طريق الطرد ، والترشيح عن طريق عمود الفصل ، والاختيار السلبي من الصفائح الدموية مع الأجسام المضادة الخاصة بي بي ار-ومكافحه حرائق الآبار مترافق إلى الخرز المغناطيسي ، وهلم جرا ، وهي تستغرق وقتا طويلا وقد تتحلل الصفائح الدموية ومحتوياتها.
ووصف فورد وزملاءه تنقيه الصفائح الدموية من الدم البشري باستخدام iohexol المتوسطة11. يستخدم هذا الأسلوب كميه مماثله من عينه الدم والمتوسطة اثناء تنقيه. وبما ان البشر ينتجون كميه أكبر من الدم ، فمن السهل نسبيا تنقيه الصفائح الدموية.
Iohexol هو التدرج الكثافة العالمية الخاملة المتوسطة القابلة للذوبان بحريه في الماء والمستخدمة في تجزئه الأحماض النووية والبروتينات والسكريات ، والبروتينات النونويه13،14. فقد منخفضه الصبغة وغير سامه ، مما يجعلها وسيله مثاليه لتنقيه الخلايا الحية السليمة11. وهو وسيله غير الجسيمات; ولذلك ، يمكن تحديد توزيع الخلايا في التدرج باستخدام مقياس الكريات الدموية ، وتدفق الخلوي ، أو مقياس الطيف الطيفي. وهو لا يتداخل مع معظم التفاعل الانزيمي أو الكيميائي للخلايا أو الشظايا الخلوية بعد التخفيف.
الفاره بمثابه نموذج الحيوانية الهامه للعديد من الامراض البشرية15،16،17،18. هناك عدد قليل من المقالات المنشورة التي تصف تنقيه الصفائح الدموية الماوس19,20. ومع ذلك ، ينتج الماوس حجما أصغر نسبيا من الدم ، مما يجعل من الصعب تنقيه الصفائح الدموية. إذا تم استخدام نفس الحجم الصغير من التدرج المتوسط وعينات الدم ، لا يمكن فصل طبقه الصفائح الدموية بشكل واضح من طبقه ار بي سي-الكريات البيضاء بعد طرد. في هذه المقالة ، وصفنا طريقه سريعة وبسيطه لتنقيه الصفائح الدموية الماوس مع ثلاثه اضعاف أكثر iohexol التدرج المتوسطة بالنسبة لحجم عينه الدم وانخفاض سرعه طرد. قمنا أيضا بتنشيط الصفائح الدموية المنقية مع الفحص والتحقيق في جودتها مع التدفق الخلوي والمجهر.
Protocol
Representative Results
Discussion
عاده ، يتم عزل الصفائح الدموية بواسطة طرد منخفضه السرعة التي تعطي البلازما الغنية بالصفائح الدموية التي تحتوي علي عدد كبير من خلايا الدم ، والحطام الخلوي ، وبروتينات البلازما التي يمكن ان تتداخل مع الاختبارات البيوكيميائية والفسيولوجية والاحتياجات بعيده تنقيه21. ولذلك ، من ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من خلال التمويل الاولي لمؤسسه سينسيناتي لبحوث الأطفال ومنحه جامعه سينسيناتي التجريبية الانتقالية إلى محمد ناظم ونود ان نشكر الدراسات الخلوية في مستشفي الأطفال سينسيناتي لتدفق البحوث الاساسيه لخدماتهم.
Materials
| APC rat anti-mouse/human CD62P (P-selectin) | Thermoscientific | 17-0626-82 | Platelets activation marker |
| Eppendorf tube | Fisher Scientific | 14-222-166 | Tube for centifuge |
| FACS DIVA software | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FACS tube | Fisher Scientific | 352008 | Tubes for flow cytomtery |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 26140079 | Ingredient for staining buffer |
| FITC rat anti-mouse CD41 | BD Biosciences | 553848 | Platelets marker |
| Flow cytometer | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FlowJo software | FlowJo, Inc. | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) | EMD Millipore | 03-34-0001 | Prevent platelet clot formation |
| Hematocrit Capillary tube | Fisher Scientific | 22-362566 | Blood collection capillary tube |
| Hemavet | Drew Scientific | Non-catalog item | Blood cell analyzer |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | Cell counting chamber |
| Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Use to Anesthetize mouse |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Nycodenz (Histodenz) | Sigma-Aldrich | D2158 | Gradient medium |
| PE rat anti-mouse CD45 | BD Biosciences | 561087 | WBC marker |
| PE-Cy7 rat anti-mouse TER 119 | BD Biosciences | 557853 | RBC marker |
| Pipet tips 200 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-1A | Transferring blood and platelet samples |
| Pipet tips 1000 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-2C | Transferring blood and platelet samples |
| Phosphate buffured saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14040-117 | Buffer for washing and dilution |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Physiological saline |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | 02-688-26 | Anti-coagulant |
| Staining buffer | In-house | Non-catalog item | Wash and dilution buffer |
| Steile water | In-house | Non-catalog item | Solvent |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | Swinging bucket rotor centrifuge |
| Thrombin | Enzyme Research Laboratoty | HT 1002a | Platelet activation agonist |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | Buffer for Nycodenz medium |
References
- de Witt, S. M., Verdoold, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Insights into platelet-based control of coagulation. Thrombosis Research. 133, S139-S148 (2014).
- Machlus, K. R., Thon, J. N., Italiano, J. E. Interpreting the developmental dance of the megakaryocyte: a review of the cellular and molecular processes mediating platelet formation. British Journal of Haematology. 165 (2), 227-236 (2014).
- Weyrich, A. S., Zimmerman, G. A. Platelets: signaling cells in the immune continuum. Trends in Immunology. 25 (9), 489-495 (2004).
- Nami, N., et al. Crosstalk between platelets and PBMC: New evidence in wound healing. Platelets. 27 (2), 143-148 (2016).
- Mancuso, M. E., Santagostino, E. Platelets: much more than bricks in a breached wall. British Journal of Haematology. 178 (2), 209-219 (2017).
- Hampton, T. Platelets’ Role in Adaptive Immunity May Contribute to Sepsis and Shock. Journals of the American Medical Association. 319 (13), 1311-1312 (2018).
- Sabrkhany, S., Griffioen, A. W., Oude Egbrink, M. G. The role of blood platelets in tumor angiogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Reviews on Cancer. 1815 (2), 189-196 (2011).
- Menter, D. G., et al. Platelet "first responders" in wound response, cancer, and metastasis. Cancer and Metastasis Reviews. 36 (2), 199-213 (2017).
- Fink, L., et al. Characterization of platelet-specific mRNA by real-time PCR after laser-assisted microdissection. Thrombosis and Haemostasis. 90 (4), 749-756 (2003).
- Trichler, S. A., Bulla, S. C., Thomason, J., Lunsford, K. V., Bulla, C. Ultra-pure platelet isolation from canine whole blood. BioMed Central Veterinary Research. 9, 144 (2013).
- Ford, T. C., Graham, J., Rickwood, D. A new, rapid, one-step method for the isolation of platelets from human blood. Clinica Chimica Acta. 192 (2), 115-119 (1990).
- Noisakran, S., et al. Infection of bone marrow cells by dengue virus in vivo. Experimental Hematolology. 40 (3), 250-259 (2012).
- Rickwood, D., Ford, T., Graham, J. Nycodenz: a new nonionic iodinated gradient medium. Analytical Biochemistry. 123 (1), 23-31 (1982).
- Graham, J. M., Ford, T., Rickwood, D. Isolation of the major subcellular organelles from mouse liver using Nycodenz gradients without the use of an ultracentrifuge. Analytical Biochemistry. 187 (2), 318-323 (1990).
- Milligan, G. N., et al. A lethal model of disseminated dengue virus type 1 infection in AG129 mice. Journal of General Virology. 98 (10), 2507-2519 (2017).
- Strassel, C., et al. Lentiviral gene rescue of a Bernard-Soulier mouse model to study platelet glycoprotein Ibbeta function. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (7), 1470-1479 (2016).
- Bergmeier, W., Boulaftali, Y. Adoptive transfer method to study platelet function in mouse models of disease. Thrombosis Research. 133, S3-S5 (2014).
- Bakchoul, T., et al. Recommendations for the use of the non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency mouse model in autoimmune and drug-induced thrombocytopenia: communication from the SSC of the ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (5), 872-875 (2015).
- Aurbach, K., Spindler, M., Haining, E. J., Bender, M., Pleines, I. Blood collection, platelet isolation and measurement of platelet count and size in mice-a practical guide. Platelets. , 1-10 (2018).
- Jirouskova, M., Shet, A. S., Johnson, G. J. A guide to murine platelet structure, function, assays, and genetic alterations. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 5 (4), 661-669 (2007).
- Birschmann, I., et al. Use of functional highly purified human platelets for the identification of new proteins of the IPP signaling pathway. Thrombosis Research. 122 (1), 59-68 (2008).
