Summary

뮤린 소장에서 상피 내 림프구의 활력 영상

Published: June 24, 2019
doi:

Summary

우리는 거꾸로 회전 디스크 공초점 현미경 검사법에 의해 뮤린 소장의 내장 영상을 사용하여 GFP 표지된 γδ IELs를 구상하는 방법을 기술합니다. 이 기술은 최대 4 시간 동안 점막 내의 살아있는 세포의 추적을 가능하게하고 장 내 면역 상피 상호 작용의 다양한 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

Abstract

γδ T 세포 수용체 (γδ IEL)를 발현하는 상피 내 림프구는 장 상피의 면역 감시에 중요한 역할을한다. γδ T 세포 수용체에 대한 확실한 리간드의 부족으로 인해, γδ IEL 활성화및 생체 내의 이들의 기능의 조절에 대한 우리의 이해는 제한적이다. 이것은 γδ IEL 기능 및 국부적인 미세 환경에 대한 이 세포의 반응성에 관여하는 신호 통로를 심문하는 대체 전략의 개발을 필요로 합니다. γδ IELs는 병원체 전좌를 제한하기 위하여 넓게 이해되더라도, intravital 화상 진찰의 사용은 안정상태에서 및 침략적인 병원체에 응하여 IEL/상피 상호 작용의 좌측 시간 역학을 이해하는 것이 중요했습니다. 본 명세서에서, 우리는 역회전 디스크 공초점 레이저 현미경을 사용하여 GFP γδ T 세포 리포터 마우스의 소장 점막에서 IEL 철새 거동을 시공하기 위한 프로토콜을 제시한다. 이 접근법의 최대 이미징 깊이는 2광자 레이저 스캐닝 현미경 검사법의 사용에 비해 제한적이지만, 회전 디스크 공초점 레이저 현미경 은 광표백을 감소시키고 고속 이미지 수집의 이점을 제공합니다. 사진 손상. 4D 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 T 세포 감시 동작과 이웃 세포와의 상호 작용을 실험 조작 후 분석하여 장 점막 내IEL 활성화 및 기능에 대한 추가 적인 통찰력을 제공합니다.

Introduction

상피 내 림프구(IEL)는 장 상피 내에 위치하며, 지하막을 따라 그리고 세포간 공간 내의 인접 한 상피 세포 사이에모두 발견된다 1. 5-10개의 상피 세포마다 약 1개의 IEL이 있습니다. 이러한 ILS는 장 상피 장벽2의 큰 창공의 면역 감시를 제공하는 센티넬역할을 한다. γδ T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 ILs는 뮤린 소장에서 총 IEL 집단의 최대 60%를 포함한다. γδ T 세포 결핍 마우스에 대한 연구는 장 손상, 염증 및 감염에 대한 응답으로이들 세포의 크게 보호 역할을 입증 3,4,5. Tcrd 녹아웃 마우스 6의생성에도 불구하고, γδ IEL 생물학에 대한 우리의 이해는 γδ TCR에 의해 인식된 리간드가 아직 확인되지 않았다는 사실로 인해 부분적으로 제한적으로 남아 있다7. 그 결과, 이러한 세포 집단을 연구하는 도구의 부족으로 인해 생리적 및 병리학적 조건 하에서 γδ TCR 활성화 및 기능의 역할을 조사하기가 어려워졌다. 이러한 격차를 해소하기 위해, 우리는 γδ IEL 기능및 생체 내 외부 자극에 대한 반응성에 대한 추가적인 통찰력을 제공하는 수단으로 γδ IEL 철새 행동과 이웃 장세포와의 상호 작용을 시각화하는 라이브 이미징 기술을 개발했습니다.

지난 10 년 동안, intravital 화상 진찰은 상피 세포 흘리기 8, 상피 장벽 기능 의조절을 포함하여 장 생물학의 다중 양상에 관련되었던 분자 사건의 우리의 이해를 현저하게 확장했습니다9 ,10,발광 내용의 골수성 세포 샘플링11,12,및 숙주 미생물 상호 작용11,13,14,15,16 . IEL 생물학의 맥락에서, 내활력 현미경 검사법의 사용은 IEL 운동성의 시공간역학 및 감시 행동을 중재하는 요인에 빛을 비추었습니다13,14,15, 16. 핵 GFP 발현17에의해 γδ IeLs를 표시하는 TcrdH2BeGFP (TcrdEGFP) 기자 마우스의 개발은 γδ ILs가 상피 내 의 높은 운동성이며 미생물에 반응하는 독특한 감시 행동을 나타낸다는 것을 밝혔습니다. 감염17,13,14. 최근에는, 또 다른 γδ T 세포 리포터 마우스가 전체 세포(18)의 시각화를 허용하도록 세포질에서GFP를 발현하는 (Tcrd-GDL)이 개발되었다. 유사한 방법론은 IEL 운동성19,20의역학에 G 단백질 결합 수용체(GPCR)-18 및 -55와 같은 특정 케모카인 수용체의 요구사항을 조사하기 위해 사용되어 왔다. 세포 특이적 리포터가 없는 경우, CD8α에 대한 형광 공액 항체를 생체IEL 운동성을 시각화하고 추적하는 데 사용되었으며,20. 2광자 레이저 스캐닝 현미경은 일반적으로 intravital 화상 진찰을 위해 사용되지만, 회전 디스크 공초점 레이저 현미경의 사용은 최소한의 배경 잡음으로 고속 및 고해상도 멀티 채널 이미지를 캡처하는 독특한 장점을 제공합니다. 이 기술은 장 점막의 복잡한 미세 환경 내에서 면역 / 상피 상호 작용의 시공간 역학을 해명하는 데 이상적입니다. 더욱이, 다양한 형질전환 및/또는 녹아웃 마우스 모델의 사용을 통해, 이러한 연구는 장 내 면역 및/또는 상피 세포 기능의 분자 조절에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

Protocol

모든 연구는 Rutgers 뉴저지 의과 대학 비교 의학 자원에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 실험실 동물 관리 (AALAC)-공인 시설의 평가 및 인증의 협회에서 수행되었다. 1. 마우스 준비 참고: 동물 제제 및 수술을 포함한 다음 절차는 수술 전에 30-40 분이 소요되며 현미경을 켜고 동봉 된 인큐베이터를 현미경으로 37 °C로 따뜻하게합니다. 버나?…

Representative Results

TcrdEGFP 리포터 마우스의 intravital 화상 진찰을 사용하여, 우리는 이전에 γδ IELs가 지하 막을 따라 그리고 측면 세포 간 공간 (LIS)로 이동하여 상피를 순찰하는 동적 감시 행동을 나타낸다는 것을 보여주었습니다. 상태(그림2,동영상 1)를 참조하십시오. 이 접근법은 또한 특정 세포 신호화 경로 및/또는 수용체의 억제가 γδ IEL 철새 거동에 미치…

Discussion

사내 현미경 기술의 발달은 세포 내 구조의 재구성을 관찰 할수있는 전례없는 기회를 제공했다 8,9,22,세포 – 세포 상호 작용12, 25 및 세포 이동 거동13,14,15,16,26 그렇지 …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 NIH R21 AI143892, 뉴저지 건강 재단 보조금, 부시 생물 의학 보조금 (KLE)에 의해 지원됩니다. 우리는 원고를 편집하고 대표 결과에 표시된 데이터를 제공하는 그녀의 도움 마들렌 후 감사합니다.

Materials

35mm dish, No. 1.5 Coverslip MatTek P35G-1.5-14-C
Alexa Fluor 633 Hydrazide Invitrogen A30634
BD PrecisionGlide Hypodermic needles – 27g Thermo Fisher Scientific 14-826-48
BD Slip Tip Sterile Syringe – 1 ml Thermo Fisher Scientific 14-823-434
BD Tuberculin Syringe Thermo Fisher Scientific 14-829-9
Dissecting scissors Thermo Fisher Scientific 08-940
Electrocautery Thermo Fisher Scientific 50822501
Enclosed incubation chamber OKOLAB Microscope
Eye Needles, Size #3; 1/2 Circle, Taper Point, 12 mm Chord Length Roboz RS-7983-3
Hank's Balanced Salt Solution Sigma-Aldrich 55037C
Hoechst 33342 Invitrogen H3570
Imaris (v. 9.2.1) with Start, Track, XT modules Bitplane Software
Inverted DMi8 Leica Microscope
IQ3 (v. 3.6.3) Andor Software
Ketamine Putney Anesthesia
Kimwipes VWR 21905-026
McPherson-Vannas scissors 3” (7.5 cm) Long 5X0.15mm Straight Sharp Roboz RS-5600
Non-absorbable surgical suture, Silk Spool, Black Braided Fisher Scientific NC0798934
Nugent Forceps 4.25” (11 cm) Long Angled Smooth 1.2mm Tip Roboz RS-5228
Puralube Vet Ointment Dechra Lubricating Eye Ointment
Spinning disk Yokogawa CSU-W1 with a 63x 1.3 N.A. HC PLAN APO glycerol immersion objective, iXon Life 888 EMCCD camera, 405 nm diode laser, 488 nm DPSS laser, 640 nm diode laser Andor Confocal system
Xylazine Akorn Anesthesia

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Cite This Article
Jia, L., Edelblum, K. L. Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine. J. Vis. Exp. (148), e59853, doi:10.3791/59853 (2019).

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