Este estudio describe la hidratación clásica utilizando el método de película lipídica delgada para la preparación de nanoliposomas seguido de caracterización de nanopartículas. Una proteína hidrofílica y globular de 47 kDa, la alcina, se encapsula con éxito como una estrategia para mejorar la estabilidad, evitar el aclaramiento rápido y promover la liberación controlada. El método se puede adaptar a la encapsulación de moléculas hidrofóbicas.
Las nanocápsulas liposoma se han aplicado para muchos propósitos en las industrias farmacéutica, cosmética y alimentaria. Los atributos de los liposomas incluyen su biocompatibilidad, biodegradabilidad, no inmunogenicidad, no toxicidad, y la capacidad de atrapar compuestos hidrófilos e hidrófobos. La hidratación clásica de películas lipídicas delgadas en un disolvente orgánico se aplica aquí como una técnica para encapsular la alcina, una lectina vegetal, en nanoliposomas. El tamaño del nanoliposoma, la estabilidad, la eficiencia del atrapamiento y la caracterización morfológica se describen en detalle. Los nanoliposomas se preparan utilizando 1,2-dioleoyl-sn-glicerol-3-fosfoethanolamine (DOPE), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamina-N-[amino(polietilenglicol)-2000] (sal de amonio; DSPE-MPEG 2000), y el colesterylhemisuccinate (CHEMS) como los principales componentes. Los lípidos se disuelven primero en cloroformo para obtener una fina película lipídica que posteriormente se rehidrata en solución de sulfato de amonio que contiene la proteína que se va a atrapar e incubar durante la noche. A continuación, se aplican técnicas de sonicación y extrusión para generar vesículas unilamelares de tamaño nanométrico. El tamaño y el índice de polidispersidad de las nanovesículas se determinan mediante la dispersión dinámica de la luz, mientras que la morfología de la nanovesícula se evalúa mediante la exploración de microscopía electrónica. La eficiencia del atrapamiento viene determinada por la relación entre la cantidad de proteína no encapsulada y la cantidad original de proteína cargada inicialmente. Los liposomas homogéneos se obtienen con un tamaño medio de 155 nm y un valor de índice de polidispersidad de 0,168. Se logra una alta eficiencia de atrapamiento del 83%.
El número de estudios que investigan sistemas eficientes de administración de medicamentos ha aumentado en los últimos años. Sin embargo, todavía es necesario superar limitaciones como el aclaramiento rápido, la mala biodistribución y la solubilidad en el pH fisiológico y la ingesta celular insuficiente. El uso de nanosistemas ha surgido como un progreso reciente en las terapias contra el cáncer, aplicada para aumentar la concentración intracelular de fármacos dentro de las células cancerosas mientras se minimiza la toxicidad en las células sanas. Además, las nanopartículas obtenidas de una gama diferente de materiales (es decir, polímeros, dendrímeros, liposomas, virus, nanotubos de carbono y metales como el óxido de hierro y el oro) se están aplicando actualmente para mejorar los efectos anticancerígenos y reducir los efectos sistémicos toxicidad1. Las nanocápsulas liposoma en particular se han aplicado para muchos propósitos en las industrias farmacéutica, cosmética y alimentaria. En los últimos años, varios productos nutracéuticos como vitaminas, enzimas y extractos herbarios han sido formulados utilizando la tecnología de liposomas2.
Los liposomas son vesículas esféricas que consisten en una o más bicapas lipídicas concéntricas formadas espontáneamente por la dispersión de fosfolípidos en medios acuosos3,4. Las cabezas polares de los fosfolípidos se encuentran en las superficies externas e internas de las membranas, en contacto con el ambiente acuoso. Por el contrario, las cadenas de ácidos grasos formanel núcleo hidrófobo de las membranas y están protegidas del agua 5. Algunos atributos de los liposomas que los hacen atractivos sistemas de administración de fármacos incluyen su biocompatibilidad, biodegradabilidad, no inmunogenicidad, no toxicidad, y la capacidad de atrapar compuestos hidrófilos e hidrófobos6.
Los liposomas se pueden preparar utilizando varios pasos de procesos como agitación, sonicación, extrusión, liofilización, congelación y descongelación. Los métodos clásicos incluyen evaporación de fase inversa, inyección de disolvente y diálisis detergente. El método más aplicado es la hidratación delgada de la película lipídica, también conocida como el método de Bangham, que se utiliza para obtener formas de lípidos vesiculares7,8,9,10,11. Lamelaridad (el número de bicapas de fosfolípidos) y el tamaño de las partículas son parámetros clásicos utilizados para caracterizar liposomas como 1) vesículas unilamelares (Ultv), formadas por una bicapa de fosfolípidos única y que varían en tamaño de la siguiente manera: i) pequeñas vesículas unilamellar vesículas (SUVs, 0,02-0,20 m), ii) vesículas unilamelares grandes (LUVs, 0,2-1,0 m) y iii) vesículas unilamelares gigantes (GUVs, >1 m); o 2) vesículas multilamelar (MlVs, >0,1 ám)3,12. El tamaño de la vesícula es un parámetro importante a la hora de considerar para uso terapéutico, como en el tratamiento del cáncer, en elque los tamaños de <200 nm son ideales para permitir que las nanovesículas crucen la barrera endotelial y alcancen los tejidos tumorales 4.
En este documento, el procedimiento de encapsulación después de la hidratación clásica de una técnica de película lipídica delgada7 se describió utilizando tarin, una lectina vegetal caracterizada como una proteína globular hidrófila13,14,15 . Las vesículas nanométricas se producen mediante la inclusión de pasos de sonicación y extrusión en la técnica principal, lo que resulta en nanovesículas liposómicas estables con alta eficiencia de atrapamiento16.
El protocolo descrito en este documento fue probado por Correa et al.16 para encapsular la alcina, una lectina inmunomoduladora y antitumoral purificada de Colocasia esculenta22. La metodología dio resultados exitosos, permitiendo la producción de nanoliposomas estables de tamaño adecuado para aplicaciones terapéuticas. La formulación presenta liberación controlada a diferentes niveles de pH bajo condiciones fisiológicas. También potencia las propiedades farmacológicas de la tarína, como la inhibición del glioblastoma humano U-87 MG y el cáncer de mama Líneas celulares MDA-MB-231 y la estimulación de las células de la médula ósea de ratones. La preparación liposomal no mostró efectos tóxicos en células de ratones sanos16.
El método clásico, descrito por primera vez por Bangham et al.7, permite la producción de grandes vesículas liposomas multilamelares, heterogéneas en tamaño y forma. Las adaptaciones de este método, como se ha informado en el presente estudio, se aplican con éxito mediante la inclusión de pasos adicionales como sonicación y extrusión a través de una membrana de policarbonato de 0,2 m. Esto permite la producción de una dispersión más homogénea con respecto al tamaño en el rango de nanómetros16,23,24. Por lo tanto, para asegurar los resultados exitosos, el protocolo de encapsulación y la formulación liposomal descritos aquí deben seguirse estrictamente.
La composición nanoliposoma fue cuidadosamente seleccionada con el fin de asegurar la formación de una membrana bicapa con DOPE, MPEG 2000-DSPE, y CHEMS como los principales componentes. Estos son componentes bicapa de membrana animal natural y este último puede conferir fluidez a la arquitectura nanoliposoma, asegurando una amplia aplicación para la entrega de compuestos bioactivos en seres humanos.
La pegilación nanoliposoma es esencial para garantizar la estabilidad de la estructura de liposoma. La ausencia de PEG conduce a la ampliación del tamaño, un alto índice de polidispersidad y una baja eficiencia de atrapamiento. Los resultados óptimos se pueden obtener con DOPE como componente principal de liposomas. Sin embargo, este es un fosfolípido de alto costo. Los costos financieros de la producción de nanoliposomas se pueden lograr reemplazando DOPE con otros lípidos similares como DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glicero-3-fosfocolina). CHEMS es una molécula de colesterol que se encuentra naturalmente en las membranas celulares animales, que no debe excluirse de la formulación, ya que es importante garantizar la fluidez bicapa lipídica y maleabilidad16.
Otros aspectos del protocolo de encapsulación también se pueden adaptar. El cloroformo utilizado para disolver los componentes liposomales puede ser reemplazado fácilmente por metanol sin efectos sobre el tamaño promedio, homogeneidad y eficiencia de atrapamiento. Sin embargo, algunas fugas de proteínas pueden ocurrir en el almacenamiento a menos de 4 oC16. El paso de incubación durante la noche con solución de sulfato de amonio que contiene altina no es obligatorio; sin embargo, por conveniencia se puede realizar sin dañar las características biofísicas nanoliposomales, encapsulación, o pérdidas de eficiencia de estabilidad, como lo demuestra Correa y otros16. El paso de extrusión se realiza a temperatura ambiente, lo que puede disminuir el caudal entre las jeringas si se utiliza una membrana de tamaño de poro de 0,1 m.
Para superar este problema, se debe considerar el uso de una membrana de tamaño de poro de 0,2 m o el calentamiento del soporte del extrusor por encima de la temperatura de transición lipídica. El analista debe tener cuidado de no dañar los lípidos o proteínas que se pueden desactivar y perder actividad biológica. Alternativamente, la preparación liposomal se puede dializar contra HBS en lugar de ultracentrifugación, utilizando una membrana de corte según el peso molecular de la proteína. La elección de la naturaleza química del tampón en el que se suspenden los nanoliposomas después de la ultracentrifugación está directamente relacionada con su aplicación posterior. Dado que las perspectivas de este estudio incluyen ensayos in vivo e in vitro, la suspensión en la solución salina tamponada HEPES fue adecuada para garantizar que no haya efectos citotóxicos y un rango de pH cercano a las condiciones fisiológicas.
Los liposomas deben ser tratados finamente, similares a las células vivas, para obtener imágenes SEM de mayor calidad. Los procedimientos de fijación y secado son importantes para garantizar la visualización de vesículas intactas más pequeñas que soportan valores superiores a 20 kV en condiciones de vacío. Figura 2 A,B muestra vesículas nanométricas compatibles con el procedimiento de extrusión. La visualización de vesículas de 51-396 nm es posible si se realiza una preparación adecuada de la muestra después de este procedimiento. Los pasos incluyen la fijación, el secado mediante el aumento de las concentraciones de etanol y la deshidratación química para evitar la formación de agregados y vesículas rotas causadas por el vacío y el haz de electrones. Por otro lado, la Figura 2C,D muestra vesículas liposomas secas a temperatura ambiente y no sometidas a ningún tratamiento descrito aquí, lo que significa que se prepararon inadecuadamente. Como resultado del procedimiento inadecuado, se forman vesículas gigantes, incluso después de la extrusión a través de una membrana de tamaño de poro de 0,2 m. Las vesículas rotas también se observan en ambos paneles como resultado del daño al vacío y al haz de electrones.
Las vesículas nanoliposomas se han explorado como un sistema de encapsulación y administración de moléculas hidrófobas, incluyendo resveratrol (3,5,4′-trihidroxistilbeno), un compuesto bioactivo contra las células cancerosas colorrectales. El procedimiento de encapsulación puede superar la baja solubilidad de los compuestos lipofílicos, además de proporcionar biocompatibilidad, biodegradabilidad, no inmunogenicidad y características no toxicidadinherentes a las nanocápsulas liposófilas25. Las adaptaciones del protocolo deben tenerse en cuenta en función de la vía y el propósito de administración, como el desarrollo de nuevas formulaciones de liposomas para la administración oral.
The authors have nothing to disclose.
Los autores están agradecidos a las instalaciones de COPPE/UFRJ, Electronic Microscopy Laboratory y Multiuser Materials Characterization Laboratory; al Dr. Adalberto Vieyra, A la Dra. Jennifer Lowe y Rafael Lindoso, profesores de la Universidad Federal de Río de Janeiro, UFRJ, Brasil, para el uso de la ultracentrífuga; al Dr. Alexandre Guedes Torres y Daniel Perrone, profesores de la Universidad Federal de Río de Janeiro, UFRJ, Brasil, para el uso del evaporador rotatorio; al profesor Roland Bodmeier y al Dr. Andriy Dashevskiy de la Universidad Freie de Berlín, quienes ayudaron con los recursos, proporcionaron nuevas metodologías y supervisaron acNTF durante una beca Erasmus+ de 6 meses en Alemania; a la Dra. Rossana Thiré y Aline Fernandes, profesora y técnico de la Universidad Federal de Río de Janeiro, UFRJ, Brasil, para el uso de Zetasizer Malvern; a Bluma Guenther y Taissa Rodrigues, profesora y técnico de la Universidad Federal de Río de Janeiro, UFRJ, Brasil, para el uso del SEM; a la Dra. Rachel Ann Hauser Davis, investigadora de la Fundación Oswaldo Cruz, para su narración. Este estudio fue financiado en parte por la Coordenao de Aperfei-oamento de Pessoal de Nível Superior, Brasil (CAPES) – Código Financiero 001 (concesión No 1627392; 1811605); por la Fundación Carlos Chagas Filho de Amparo á Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (concesión No. E-26/202.815/2018; E-26/202.815/2018; E-26/203.039/2015 y E-26/202.860/2016); por Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico y Tecnológico (CNPq) (concesión No 406601/2018-6), y Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP).
Ammonium Sulfate | Sigma-Aldrich Co | A4418 | |
Analitycal Ballance Mettler H10Tw | Mettler Inc. | 417870 | |
Beckman DU-640 Spectrophotometer | Beckman Coulter | 8043-30-1090 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich Co | 5470 | |
BUCHI Rotavapor R-300 Rotary Evaporator with Controller and V-300 Pump | Thermo Fischer Scientific | 05-001-022PM | |
CHEMS (cholesterylhemisuccinate) | Sigma-Aldrich Co | C6512 | |
Chloroform | Sigma-Aldrich Co | 48520-U | CAUTION |
Copper (II) Sulfate (Pentahydrate) | Sigma-Aldrich Co | 209198 | |
Coverslips (13mm diameter) | Thermo Scientific Nunc | EW-01839-00 | |
DOPE(1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine) | Lipoid GMBH | 565600.1 | |
Ethanol Absolute | Sigma-Aldrich Co | 32205 | |
Folin -Ciocalteu phenol reagent | Sigma-Aldrich Co | F9252 | |
Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich Co | G5882 | |
HEPES | Sigma-Aldrich Co | H3375 | |
Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich Co | 440191 | CAUTION |
JEOL JSM-6460 LV Sacnning Electron Microscope | JEOL LTD | ||
Mini Extruder 7 | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
MPEG 2000-DSPE 1,2-distearoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Lipoid GMBH | 588200.1 | |
Optima L-90k Ultracentrifuge | Beckman Coulter | PN LL-IM-12AB | |
Phosphate Buffer | Sigma-Aldrich Co | P3619 | |
Poli-L-lysine | Sigma-Aldrich Co | P8920 | |
Potassium L-tartrate monobasic | Sigma-Aldrich Co | 243531 | |
Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich Co | S7795 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich Co | S7653 | |
Sodium Deoxycholate (DOC) | Sigma-Aldrich Co | D6750 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich Co | L3771 | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich Co | S8045 | |
Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma-Aldrich Co | RES20908-A7 | |
TESCAN VEGA 3 Scanning Electron Microscope | Tescan | #657874 | |
Trichloroacetic Acid (TCA) | Sigma-Aldrich Co | 91230 | |
Zetasizer Nano ZSP | Malvern Panalytical LTD | ||
Ultrasonic cleaning bath model 2510 | Branson |