Fluorescentend gelabelde bacteriën als een Tracer om nieuwe trajecten van organische koolstof stromen in aquatische ecosystemen te onthullen
Summary
Hier is een protocol voor een eencellige, epifluorescentie microscopie gebaseerde techniek om Graas percentages te kwantificeren in aquatische roofzuchtige eukaryoten met een hoge precisie en taxonomische resolutie.
Abstract
Elucidating trofische interacties, zoals predatie en de effecten ervan, is een frequente taak voor veel onderzoekers in de ecologie. De studie van microbiële gemeenschappen heeft vele beperkingen, en het bepalen van een roofdier, prooi, en roofzuchtige tarieven is vaak moeilijk. Hier is een geoptimaliseerde methode gebaseerd op de toevoeging van fluorescently gelabelde prooi als een Tracer, die een betrouwbare kwantificatie van de Graas percentages in aquatische roofzuchtige eukaryoten mogelijk maakt en een schatting van de overdracht van voedingsstoffen naar hogere trofische niveaus.
Introduction
Heterotrofische prokaryoten zijn een belangrijke biologische component in aquatische systemen en vormen een belangrijke fractie van de biomassa van het plankton1,2,3. Factoren die hun overvloed, diversiteit en activiteit beheersen, zijn cruciaal voor het begrijpen van hun rol in biogeochemische Cycling (d.w.z. het lot van organische koolstof en andere voedingsstoffen en stroom van energie van prokaryoten naar hogere trofische niveaus). Protozoan begrazing is een van deze belangrijke factoren. Bacterivory van heterotrofische nanoflagellates en ciliaten legt een sterke top-down controle over prokaryotische overvloed, Gemeenschap functie, structuur, diversiteit, en zelfs cellulaire morfologie en groeisnelheid van bepaalde bacteriële groepen4, 5,6. In sommige systemen dienen protisten als de belangrijkste oorzaak van bacteriële sterfte op6,7.
De standaardbenadering gebruikt om protozoeen bacterivory te beoordelen, die nu al enige tijd wordt gebruikt, omvat het gebruik van fluorescently gelabelde bacteriën (FLB) als prooi analogen en epifluorescentie microscopie. Celspecifieke opnamesnelheden kunnen worden bepaald door het aantal gelabelde prooi deeltjes in protistan voedsel vacuolen te kwantificeren over een geselecteerde tijd cursus8. Deze aanpak heeft een aantal voordelen. Tracer wordt toegevoegd aan natuurlijke monsters met natuurlijke roofdieren en prooi assemblages. Er is een minimale monster manipulatie voorafgaand aan incubatie, minimale monster wijziging door de toegevoegde FLB Tracer, en incubatie tijden zijn kort om goede resultaten te garanderen die onder de omstandigheden in situ zijn verkregen. Als alternatief kan in omgevingen met lage aantallen bacteriële protisten of zoöplankton (bv. offshore mariene systemen) de verdwijningen van FLB toegevoegd aan monsters in lage hoeveelheden (2%-3% Tracer) worden gedetecteerd via Flowcytometrie in lange termijn (12-24 h) incubatie experimenten. Vervolgens worden de nummers van de FLB aan het begin-en eindpunt (integratie van de impact van alle bacterieomen) gekwantificeerd door flowcytomeltry (zie vorige publicatie9voor meer informatie). Een dergelijke parameter vertegenwoordigt echter alleen de totale geaggregeerde bacterivory percentages die niet direct kunnen worden toegeschreven aan bepaalde protistan-en zoöplankton Grazer groepen of soorten.
Over het algemeen kan het een uitdaging zijn om de protistan soorten-of morphotype-specifieke bacteriële sterftecijfers in het aquatische milieu nauwkeurig en met ecologische betekenis te kwantificeren. Sommige protisten zijn selectieve grazers, en de grootte en de celvorm van de toegevoegde FLB Tracer kunnen de natuurlijke tarieven van prooi inname10,11verstoren. Bovendien zijn protistan activiteit en metabolisme zeer temperatuurgevoelig12; Daarom moet de hoeveelheid toegevoegde FLB Tracer zorgvuldig worden gemanipuleerd voor elk afzonderlijk monster type (niet alleen op basis van de natuurlijke overvloed, grootte, en morfologie van bacteriën en de heersende soorten bactervores, maar ook op temperatuur). De meeste studies richten zich op bulk protistan grazende activiteit; de bacterivory van specifieke protistan soorten heeft echter vaak een veel hogere informatiewaarde en kan de voorkeur hebben. In dit geval is de taxonomische kennis van de protist soorten die in een steekproef aanwezig zijn en het begrip van hun gedrag noodzakelijk. Vandaar dat er aanzienlijke hoeveelheden tijd en arbeid nodig zijn om goede resultaten te behalen op soortspecifieke tarieven van bacterivory die toe te schrijven zijn aan een bepaalde protistan groep of soort.
Ondanks deze moeilijkheden blijft deze aanpak het meest geschikte instrument dat momenteel beschikbaar is om protistan bacterivory in natuurlijke instellingen te beoordelen. Hier gepresenteerd is een uitgebreide, gemakkelijk te volgen methode voor het gebruik van FLB als een Tracer in aquatische microbiële ecologie studies. Alle genoemde problematische aspecten van de aanpak worden verantwoord en een verbeterde workflow wordt beschreven, met twee experimenten uit contrasterende omgevingen en contrasterende ciliate soorten als voorbeelden.
De eerste casestudy werd uitgevoerd in een epilimnetische omgeving van het mesotrofische Římov waterreservoir in de Tsjechische Republiek, dat Grazer en bacteriële Abundances vertoont die vergelijkbaar zijn met de meeste oppervlakte zoet waterlichamen (cf.5,7). De tweede casestudy werd uitgevoerd in de zeer specifieke omgeving binnen vallen van de aquatische vleesetende plant ,die een extreem hoge aantallen van beide grazende mixotrofische ciliaten (tetrahymena utaanariae) heeft. en bacteriële cellen. Berekeningen van de celspecifieke Graas percentages en bacteriële staande voorraden in beide soorten monsters worden weergegeven. Een reeks van ecologische interpretaties van de resultaten wordt dan besproken, en voorbeelden van mogelijke follow-up studies worden uiteindelijk voorgesteld.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deciphering trofische interactie in aquatische systemen is altijd uitdagend28, vooral op de nano-plankton schalen waarbij protisten en hun prooi, bacteriën. Als het gaat om nutriëntenopname trajecten en kwantificering, is de toepassing van methoden met succes gebruikt op hogere trofische niveaus minder mogelijk, vanwege de hoge complexiteit van biotische interacties. Deze omvatten, bijvoorbeeld, stabiele isotoop labeling benaderingen. Dit protocol toont de voordelen van het gebruik van epifluore…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd gesteund door de Tsjechische Science Foundation onder de Research Grant 13-00243S en 19-16554S toegekend aan K. Š. en D. S., respectievelijk. Dit artikel werd ook gesteund door het project “Biomanipulation als een instrument voor het verbeteren van de waterkwaliteit van stuw reservoirs” (no CZ. 02.1.01/0.0/0.0/16_025/0007417), gefinancierd door het Europees Fonds voor regionale ontwikkeling, in het operationele programma onderzoek, ontwikkeling en onderwijs.
Materials
| 0.2-µm pore-size filters | SPI supplies, https://www.2spi.com/ | B0225-MB | Black, polycarbonate track etch membrane filters, diameter approprite for filtering apparatus used |
| 5-(4,6-dichlorotriazin-2-yl) aminofluorescein (DTAF) | Any brand | ||
| Automatic pipettes with adjustable volumes | Any brand, various sizes | ||
| Centrifuge | 22 000 x g | ||
| Cryovials | Any brand, 2 mL size | ||
| DAPI (4´,6-Diamidino-2´-phenylindole dihydrochloride) | Any brand | 1 mg ml-1 | |
| Epiflorescence microscope | Magnification from 400 x up to 1000 x | ||
| Filters appropriate for viewing in the DAPI and DTAF range | |||
| Counting grid in one of the oculars | |||
| Filtering apparatus | Usually with a diameter of 25 mm | ||
| Formaldehyde | A brand for microscopy | ||
| Glutaraldehyde | A brand for microscopy | ||
| Immersion oil for microscopy | Specific oil with low fluorescence | ||
| Lugol´s solution | Any brand or see comment | Make an alkaline Lugol' solution as follows: Solution 1 – dissolve 10 g of potassium iodide in 20 ml in MQ water, then add 5 g of iodine. Solution 2 – add 5 g of sodium acetate to 50 ml of MQ water. Add the solution 2 to the solution 1 and thoroughly mix | |
| Methanol stabilized formalin | Any brand available for microscopy purposes | ||
| Microscope slides and cover slips | Any brand produced for microscopy purposes | ||
| MQ water for diluting samples | Any brand |
||
| Phosphate-buffered saline (PBS; pH = 9) | Any brand | 0.05 M Na2HPO4-NaCl solution, adjusted to pH 9 | |
| PPi-saline buffer | Any brand | 0.02 M Na4P2O7-NaCl solution. Add 0.53 g Na4P2O7 to 100 ml of MQ water plus 0.85 g NaCl | |
| Sampling device | Appropriate for obtaining representative sample | e.g. Friedinger sampler for lake plankton | |
| Sodium thiosulfate solution | Any brand | 3% solution is used in the protocol | |
| Sonicator | Any brand | 30 W | |
| Vortex | Any brand allowing thorough mixing of the solutes and samples | ||
| Water bath | Any brand allowing temperature to be maintained at 60 °C |
References
- Azam, F., et al. The ecological role of water-column microbes in the sea. Marine Ecology Progress Series. 10, 257-263 (1983).
- Šimek, K., et al. A finely tuned symphony of factors modulates the microbial food web of a freshwater reservoir in spring. Limnology & Oceanography. 59, 1477-1492 (2014).
- Šimek, K., et al. Bacterial prey food characteristics modulate community growth response of freshwater bacterivorous flagellates. Limnology & Oceanography. 63, 484-502 (2018).
- Šimek, K., et al. Changes in bacterial community composition, dynamics and viral mortality rates associated with enhanced flagellate grazing in a meso-eutrophic reservoir. Applied & Environmental Microbiology. 67, 2723-2733 (2001).
- Jürgens, K., Matz, C. Predation as a shaping force for the phenotypic and genotypic composition of planktonic bacteria. Antonie Van Leeuwenhoek. 81, 413-434 (2002).
- Pernthaler, J. Predation on prokaryotes in the water column and its ecological implications. Nature Reviews Microbiology. 3, 537-546 (2005).
- Berninger, U. B., Finlay, J., Kuuppo-Leinikki, P. Protozoan control of bacterial abundances in freshwaters. Limnology and Oceanography. 36, 139-147 (1991).
- Sherr, E. B., Sherr, B. F., Kemp, P. F., Sherr, B. F., Sherr, E. B., Cole, J. J. Protistan grazing rates via uptake of fluorescently labeled prey. Handbook of Methods in Aquatic Microbial Ecology. , 695-701 (1993).
- Vazquez-Dominguez, E., Peters, F., Gasol, J. M., Vaqué, D. Measuring the grazing losses of picoplankton: methodological improvements in the use of fluorescently tracers combined with flow cytometry. Aquatic Microbial Ecology. 20, 119-128 (1999).
- Šimek, K., et al. Ecological role and bacterial grazing of Halteria spp.: Small oligotrichs as dominant pelagic ciliate bacterivores. Aquatic Microbial Ecology. 22, 43-56 (2000).
- Montagnes, D. J. S., et al. Selective feeding behaviour of key free-living protists: avenues for continued study. Aquatic Microbial Ecology. 53, 83-98 (2008).
- Kirchman, D. L. . Processes in Microbial Ecology. 2nd Edition. , (2018).
- Porter, K. G., Feig, Y. S. The use of DAPI for identifying and counting aquatic microflora. Limnology and Oceanography. 25, 943-948 (1980).
- Foissner, W., Berger, H. A user-friendly guide to the ciliates (Protozoa, Ciliophora) commonly used by hydrobiologists as bioindicators in rivers, lakes, and waste waters, with notes on their ecology. Freshwater Biology. 35, 375-482 (1996).
- Foissner, W., Berger, H., Schaumburg, J. Identification and ecology of limnetic plankton ciliates. Informationsberichte des Bayer Landesamtes für Wasserwirtschaft Heft. , 3-99 (1999).
- Šimek, K., et al. Ciliate grazing on picoplankton in a eutrophic reservoir during the summer phytoplankton maximum: a study at the species and community level. Limnology & Oceanography. 40, 1077-1090 (1995).
- Skibbe, O. An improved quantitative protargol stain for ciliates and other planktonic protists. Archiv für. Hydrobiolgie. 130, 339-347 (1994).
- Macek, M., et al. Growth rates of dominant planktonic ciliates in two freshwater bodies of different trophic degree. Journal of Plankton Research. 18, 463-481 (1996).
- Šimek, K., et al. Microbial food webs in hypertrophic fishponds: omnivorous ciliate taxa are major protistan bacterivores. Limnology & Oceanography. , (2019).
- Jezbera, J., et al. Major freshwater bacterioplankton groups: Contrasting trends in distribution of Limnohabitans and Polynucleobacter lineages along a pH gradient of 72 habitats. FEMS Microbiology Ecology. 81, 467-479 (2012).
- Kasalický, V., et al. The diversity of the Limnohabitans genus, an important group of freshwater bacterioplankton, by characterization of 35 isolated strains. PLoS One. 8, 58209 (2013).
- Stabell, T. Ciliate bacterivory in epilimnetic waters. Aquatic Microbial Ecology. 10, 265-272 (1996).
- Zingel, P., et al. Ciliates are the dominant grazers on pico- and nanoplankton in a shallow, naturally highly eutrophic lake. Microbial Ecology. 53, 134-142 (2007).
- Bickel, S. L., Tang, K. W., Grossart, H. P. Ciliate epibionts associated with crustacean zooplankton in german lakes: distribution, motility, and bacterivory. Frontiers in Microbiology. 3 (243), (2012).
- Sirová, D., et al. Hunters or gardeners? Linking community structure and function of trap-associated microbes to the nutrient acquisition strategy of a carnivorous plant. Microbiome. 6, 225 (2018).
- Šimek, K., et al. Ecological traits of a zoochlorellae-bearing Tetrahymena sp. (Ciliophora) living in traps of the carnivorous aquatic plant Utricularia reflexa. Journal of Eukaryotic Microbiology. 64, 336-348 (2017).
- Pitsch, G., et al. The green Tetrahymena utriculariae n. sp. (Ciliophora, Oligohymenophorea) with its endosymbiotic algae (Micractinium sp.), living in the feeding traps of a carnivorous aquatic plant. Journal of Eukaryotic Microbiology. 64, 322-335 (2017).
- Nielsen, J. M., Clare, E. L., Hayden, B., Brett, M. T., Kratina, P. Diet tracing in ecology: Method comparison and selection. Methods in Ecology and Evaluation. 9, 278-291 (2018).
- Beisner, B. E., Grossart, H. P., Gasol, J. M. A guide to methods for estimating phago-mixotrophy in nanophytoplankton. Journal of Plankton Research. , 1-13 (2019).
- Dolan, J. D., Šimek, K. Processing of ingested matter in Strombidium sulcatum, a marine ciliate (Oligotrichida). Limnology and Oceanography. 42, 393-397 (1997).
- Massana, R., et al. Grazing rates and functional diversity of uncultured heterotrophic flagellates. The ISME Journal. 3, 588-596 (2009).
- Grujčić, V., et al. Cryptophyta as major freshwater bacterivores in experiments with manipulated bacterial prey. The ISME Journal. 12, 1668-1681 (2018).
