Оптимизация, дизайн и предотвращение ловушек в ручном мультиплексфлюсцентной иммуногистохимии
Summary
Multiplex флуоресцентной иммуногистохимии является новой технологией, которая позволяет визуализации нескольких типов клеток в нетронутой формалин фиксированной, парафин встроенных (FFPE) ткани. Представлены руководящие принципы для обеспечения успешного 7-цветного мультиплекса с инструкциями по оптимизации антител и реагентов, подготовке слайдов, дизайна и советов для избежания общих проблем.
Abstract
Оценка микроокружения нетронутой ткани для анализа инфильтрации клеток и пространственной организации имеет важное значение для понимания сложности процессов заболевания. Принцип методы, используемые в прошлом включают иммуногистохимии (IHC) и иммунофлуоресценции (ИФ), которые позволяют визуализации клеток в качестве снимка во времени, используя между 1 и 4 маркеров. Оба метода имеют недостатки, включая трудности с окрашиванием плохо антигенных целей и ограничения, связанные с реактивностью кросс-видов. IHC является надежным и воспроизводимым, но характер химии и опоры на спектр видимого света позволяет использовать лишь несколько маркеров и затрудняет локализацию. Использование IF расширяет потенциальные маркеры, но обычно полагается на замороженные ткани из-за обширной аутофлуоресценции тканей после фиксации формалина. Цитометрия потока, метод, который позволяет одновременное обозначение нескольких эпитопов, отменяет многие недостатки IF и IHC, однако, необходимость изучения клеток, как одна суспензия клеток теряет пространственный контекст клеток отбрасывая важные биологические Отношения. Multiplex флуоресцентной иммуногистохимии (mfIHC) мосты эти технологии, позволяющие мульти-эпитоп клеточного фенотипирования в форминале фиксированной парафин встроенных (FFPE) ткани при сохранении общей архитектуры микросреды и пространственной отношения клеток в нетронутой ненарушенной ткани. Высокофюмиорная интенсивность флюорофоров, которые ковалентно связи с эпитопом ткани позволяет несколько применений первичных антител, не беспокоясь видов конкретных кросс-реактивность вторичных антител. Хотя эта технология была доказана для получения надежных и точных изображений для изучения болезни, процесс создания полезной стратегии mfIHC окрашивания может быть трудоемким и требовательным из-за обширной оптимизации и дизайна. Для того, чтобы сделать надежные изображения, которые представляют точные клеточные взаимодействия на месте и смягчить период оптимизации для ручного анализа, представленные здесь методы подготовки слайда, оптимизация антител, мультиплекс дизайн, а также ошибки часто встречаются во время процесса окрашивания.
Introduction
Визуализация нетронутой микросреды опухоли (TME) имеет важное значение в оценке не только клеточной инфильтрации в твердых злокачественных новообразований, но и клеточных взаимодействий. Мультиплекс флуоресцентной иммуногистохимии (mfIHC) стал эффективным инструментом для мультиантигена фенотипирования клеток в исследовании рака и связанных с ними заболеваний1,2,3,4, 5,6,7. Это, в сочетании с новым программным обеспечением и программами,предназначенными для анализа больших наборов данных, позволяет наблюдать за сложными взаимодействиями между ячейками 1,2,4. Коэффициентом ограничения скорости при получении данных часто является качество окрашенных тканей до анализа.
Предыдущие методы, используемые для фенотипных клеток в TME включают иммуногистохимию (IHC), иммунофлуоресценцию (ИФ) и цитометрию потока, все из которых представляют значительные ограничения. IHC использует формалин фиксированной парафин встроенных (FFPE) ткани разделы, которые депарафинизированы и регидратированных до того, окрашенные чаще всего одно антитела. Использование хрена пероксидазы (HRP) связаны вторичные антитела и химической реакции позволяет визуализации одного антигенного эпитопа8. В то время как IHC является надежным и выполняется на ткани FFPE, с которой легко работать, ограничения видимого спектра света означают, что только один или два маркера могут быть надежными различимыми и колокализации антигенов довольно трудно8. Способ расширить доступные маркеры и, следовательно, антигены, которые могут быть исследованы на одном разделе, чтобы изменить на флуоресценцию, которая позволяет использовать более широкий спектр визуального спектра. Для IF, замороженные или FFPE ткани переносится на слайды и антитела, используемые, которые спрягаются с различными флюорофорами. Хотя это увеличивает количество антигенов, которые могут быть проверены, Есть несколько важных ограничений. Во-первых, потому что каждое антитело обычно имеет только один флюорофор прилагается, яркость часто не достаточно сильны, чтобы преодолеть аутофлуоресценции тканей. Именно по этой причине, большинство IF выполняется на замороженных тканей, которые дорого хранить и трудно работать. Ограниченное количество флуоресцентных меток доступны для использования из-за спектрального перекрытия и перекрестной реактивности видов, особенно при использовании неконъюгированных антител. Поток цитометрии, которая состоит из обработки свежей ткани в одну клетку подвески и маркировки флуоресцентными антителами был золотым стандартом для иммунофенотипирования на протяжении десятилетий9,10. Преимуществоциетрии потока является способность маркировать несколько антител без заботы о поперечной реактивности видов, поскольку большинство из них спряженные. Потому что клетки “визуализированы” машиной, а не человеческие глаза, Есть гораздо больше фторофоров доступны, но это поставляется с затратами. Компенсация должна производиться вручную, что может существенно изменить результаты, приносящие ложноположительные и отрицательные результаты. Наиболее значительным ограничением цитометрии потока является то, что архитектура тканей и впоследствии вся пространственная информация теряется из-за необходимости подвески одиночных клеток.
Мультиплекс флуоресцентной иммуногистохимии (mfIHC) с использованием автоматизированного флуоресцентного микроскопа в сочетании с новым программным обеспечением сочетает в себе преимущества IHC, IF и цитометрии потока, позволяя мульти-антигенной ткани окрашивания с усиливанием сигнала и сохранение пространственных отношений без необходимости компенсации. Ткань FFPE помещается на заряженные слайды, которые после поиска антигена, проходят раунд первичного применения антител к целевому антигену интереса, а затем вторичное антитело с химическим тегом HRP, похожим на IHC. После размещения вторичного антитела, СПЕЦИФИЧЕСКая реакция HRP приводит к флюорофору ковалентно связывая с эпитопом интереса11. После того, как ткань помечена, еще один раунд нагрева слайдов завершается удаление ранее прикладного первичного и вторичного комплекса антител, оставляя только флуоресцентный тег, привязанный к эпитопу ткани11. Это позволяет использовать несколько антител любого вида без опасений за перекрестную реактивность11,12. Чтобы свести к минимуму необходимость ручной компенсации нескольких флуоресцентных красителей, коллекция флюорофоров с небольшим спектральным перекрытием, включая ядерное пятно счетчика используется для завершения mfIHC. Для учета автофлюоресценции, встречающейся с тканью FFPE, программное обеспечение вычитает автофлюоресценцию из конечного изображения, используя изображение с пустого слайда, что возможно из-за силы антигена специфической флуоресценции после флюорофора усиление сигнала. Используя новые программы, предназначенные для больших наборов данных,расположение ячеек можно определить и проанализировать для пространственного контекста 1,2,4. Наиболее значительным ограничением этого метода является время оптимизации. Здесь найдена подробная методология с инструкциями по экспериментальному проектированию и стратегии окрашивания и визуализации. mfIHC будет полезен для лабораторий, которые в настоящее время не имеют оптимизированной автоматизированной системы окрашивания, которая хотела бы лучше понять пространственный контекст взаимодействия между клетками и клетками в нетронутой ткани FFPE с помощью ручной техники.
Protocol
Representative Results
Discussion
Нетронутые образцы тканей из твердой биопсии опухоли и хирургической резекции остаются важными диагностическими и прогностическими инструментами для анализа заболеваний, а также прогнозом пациента. Мультиплекс флуоресцентная иммуногистохимия (mfIHC) является новым методом, который с?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Эда Стака, ранее от Перкина Элмера, за помощь в настройке и оптимизации оригинального мультиплексного окрашивания. Авторы также хотели бы поблагодарить Кристен Шмидт из Akoya Biosciences за советы с использованием программного обеспечения для анализа. Исследование, о которых сообщается в этой публикации, было поддержано Национальными институтами здравоохранения по борьбе с раком под номером премии P30CA046592, K08CA201581 (tlf), K08CA234222 (js), R01CA15158807 (mpm), RSG1417301CSM (mpm), R01CA19807403 (mpm), U01CA224144501 (mpm, hc), CA170568 (hc). Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно отражает официальные взгляды Национальных институтов здравоохранения. Дополнительную поддержку оказали Джеффри Колби Колби Колона рака и Том А. Лю Мемориал научно-исследовательских фондов.
Materials
| 100% ethanol | Fisher | HC8001GAL | |
| 70% ethanol | Fisher | HC10001GL | |
| 95% ethanol | Fisher | HC11001GL | |
| Analysis software | Akoya Biosciences | CLS135783 | inForm version 2.3.0 |
| Antifade mountant | ThermoFisher | P36961 | ProLong Diamond |
| Blocking solution | Vector | SP-6000 | Bloxall |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Life Sciences | A9647-100G | |
| Cover Slips | Fisher | 12-548-5E | |
| Delicate task wipe | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Fluorescent diluent | Akoya Biosciences | ARD1A01EA | Opal TSA diluent |
| Fluorophore 520 | Akoya Biosciences | FP1487001KT | 1:100 |
| Fluorophore 540 | Akoya Biosciences | FP1494001KT | 1:100 |
| Fluorophore 570 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | 1:100 |
| Fluorophore 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | 1:100 |
| Fluorophore 650 | Akoya Biosciences | FP1496001KT | 1:100 |
| Fluorophore 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | 1:100 |
| Fluorophore DAPI | Akoya Biosciences | FP1490 | 3 drops in TBST or PBS |
| Heat resistant box | Tissue-Tek | 25608-904 | Plastic slide box-green |
| Humidified Chamber | Ibi Scientific | AT-12 | |
| Hybridization oven | FisherBiotech | ||
| Hydrophobic barrier pen | Vector | H-4000 | ImmEdge |
| Microscope | Perkin Elmer | CLS140089 | Mantra quantitative pathology workstation |
| Microwave | Panasonic | NN-A661S | with inverter technology |
| Neutral buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | 10% neutral buffered formalin |
| pH 6 antigen retrieval buffer | Akoya Biosciences | AR600 | AR6 |
| pH 9 antigen retrieval buffer | Akoya Biosciences | AR900 | AR9 |
| Phosphate buffered saline | Fisher | BP3994 | PBS |
| Plastic slide box | Tissue-Tek | 25608-906 | |
| Plastic wrap | Fisher | NC9070936 | |
| Polysorbate 20 | Fisher | BP337-800 | Tween 20 |
| Primary antibody CD163 | Lecia | NCL-LCD163 | 1:400 |
| Primary antibody CD3 | Dako | A0452 | 1:400 |
| Primary antibody CD8 | Spring Bio | M5390 | 1:400 |
| Primary antibody FOXP3 | Dako | M3515 | 1:400 |
| Primary antibody pancytokeratin | Cell Signaling | 12653 | 1:500 |
| Primary antibody PD-L1 | Cell Signaling | 13684 | 1:200 |
| Secondary antibody | Akoya Biosciences | ARH1001EA | Opal polymer |
| Slide stain set | Electron Microscopy Sciences | 6254001 | |
| Tris buffered saline | Corning | 46-012-CM | TBS |
| Vertical slide rack | Electron Microscopy Sciences | 50-294-72 | |
| Xylene | Fisher | X3P1GAL |
References
- Lazarus, J., et al. Spatial and phenotypic immune profiling of metastatic colon cancer. JCI Insight. 3 (22), (2018).
- Barua, S., et al. A Functional Spatial Analysis Platform for Discovery of Immunological Interactions Predictive of Low-Grade to High-Grade Transition of Pancreatic Intraductal Papillary Mucinous Neoplasms. Cancer Informatics. 17, 1176935118782880 (2018).
- Yang, L., Liu, Z., Tan, J., Dong, H., Zhang, X. Multispectral imaging reveals hyper active TGF-beta signaling in colorectal cancer. Cancer Biology & Therapy. 19 (2), 105-112 (2018).
- Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nature Communications. 8, 15095 (2017).
- Steele, K. E., Brown, C. Multiplex Immunohistochemistry for Image Analysis of Tertiary Lymphoid Structures in Cancer. Methods In Molecular Biology. 1845, 87-98 (2018).
- Gorris, M. A. J., et al. Eight-Color Multiplex Immunohistochemistry for Simultaneous Detection of Multiple Immune Checkpoint Molecules within the Tumor Microenvironment. The Journal Of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7, (2017).
- Katikireddy, K. R., O’Sullivan, F. Immunohistochemical and immunofluorescence procedures for protein analysis. Methods In Molecular Biology. 784, 155-167 (2011).
- Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: basic principles and applications. Critical Reviews In Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).
- Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Review of Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Zhang, W., et al. Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies. Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).
- Phenoptics Research Solutions. . Perkin Elmer Manual. , 32 (2016).
- . . Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , (2014).
- Carey, C. D., et al. Topological analysis reveals a PD-L1-associated microenvironmental niche for Reed-Sternberg cells in Hodgkin lymphoma. Blood. 130 (22), 2420-2430 (2017).
