Summary

Uso de ensaios de entrada viral e análise de ancoragem molecular para a identificação de candidatos antivirais contra coxsackievirus a16

Published: July 15, 2019
doi:

Summary

O objetivo do protocolo é ilustrar os diferentes ensaios relativos à entrada viral que podem ser utilizados para identificar os inibidores da entrada viral do candidato.

Abstract

Ensaios antivirais que examinam mecanisticamente a entrada viral são pertinentes para discernir em que etapa os agentes avaliados são mais efetivos e permitem a identificação de inibidores da entrada viral do candidato. Aqui, apresentamos as abordagens experimentais para a identificação de pequenas moléculas capazes de bloquear a infecção pelo coxsackievirus não envelopado A16 (CVA16) através da segmentação das partículas de vírus ou etapas específicas na entrada viral precoce. Os ensaios incluem a análise do tempo de adição de drogas, o ensaio de ligação viral à base de citometria de fluxo e o ensaio de inativação viral. Nós igualmente apresentamos um protocolo de encaixe molecular que utiliza proteínas do capsídeo do vírus para prever os resíduos potenciais alvejados pelos compostos antivirais. Estes ensaios devem ajudar na identificação de agentes antivirais candidatos que atuam na entrada viral. As direções futuras podem explorar esses possíveis inibidores para o desenvolvimento de drogas.

Introduction

A doença da mão, do pé, e da boca (hfmd) é uma doença causada o mais geralmente pelo coxsackievirus A16 (CVA16) e pelo enterovírus 71 (EV71) em crianças novas. Recentemente, em toda a região da Ásia-Pacífico, houve um aumento significativo na HFMD induzida por CVA16. Embora os sintomas possam ser leves, podem ocorrer complicações graves que afetam o cérebro e o coração, com potencial fatalidade1,2. Atualmente, não há terapias antivirais licenciadas ou vacinações disponíveis para CVA16, e, portanto, há uma necessidade urgente de desenvolver estratégias antivirais para conter surtos futuros e as complicações associadas.

CVA16 é um vírus não-envelopado que tenha um capsídeo icosahedral montado dos pentâmeros que cada um contem 4 proteínas estruturais a saber VP1, VP2, VP3, e VP4. Circundando cada eixo cinco vezes no pentâmero é uma região ‘ Canyon ‘ que mostra como uma depressão e é notável por seu papel na ligação do receptor3. Na parte inferior deste Canyon encontra-se um bolso hidrofóbico na região VP1 que contém um ligante gordo natural chamado esfingosina (SPH). Receptores celulares, como a glicoproteína de P selectina humana ligante 1 (PSGL-1) e o membro da classe B do receptor de scavenger 2 (SCARB2), têm sido sugeridos para desempenhar um papel na ligação viral, deslocando este ligante que resulta em alterações conformacionais para o capsídeo e o subsequente ejeção do genoma viral na célula hospedeira4,5,6. A identificação de possíveis inibidores que bloqueiam os eventos sucessivos no processo de entrada viral pode fornecer estratégias terapêuticas potenciais contra a infecção por CVA16.

As etapas do ciclo de vida do vírus podem ser dissecadas por meio de abordagens experimentais como alvos para ajudar a identificar agentes antivirais específicos do modo. Uma análise da tempo–droga-adição examina o efeito do tratamento da droga em épocas diferentes durante a infecção viral, incluindo o pre-entry (adicionado antes da infecção do vírus), entrada (adicionado simultâneo à infecção do vírus), e borne-entrada (adicionado depois do Infeção pelo vírus)7. O impacto pode ser avaliado usando um ensaio de placa padrão, quantitando o número de chapas virais formadas em cada uma das condições de tratamento. O ensaio de ligação viral à base de citometria de fluxo determina se a droga impede o apego viral às células hospedeiras. Isto é conseguido deslocando a temperatura de 37 ° c, em que a maioria de infecções humanas do vírus ocorre, a 4 ° c, onde os virions podem se ligar à superfície da pilha do anfitrião mas são incapazes de incorporar as pilhas7. As partículas de vírus ligadas à membrana celular são então quantificadas por imunocoloração contra antígenos virais e avaliadas por citometria de fluxo. O ensaio de inativação viral, por outro lado, ajuda a avaliar potenciais interações físicas da droga com partículas de vírus livres, protegendo ou neutralizando os virions, ou causando agregações ou alterações conformacionais que os tornam inativos para interações subsequentes com a superfície celular do hospedeiro durante a infecção8,9. Neste experimento, o inuso viral é permitido incubar primeiro com a droga antes de ser diluído para titular para fora a droga antes de infectar a monocamada da pilha de anfitrião e de executar um ensaio padrão da chapa8. Finalmente, o encaixe molecular é uma ferramenta poderosa para prever locais potenciais da interação da droga na superfície do virion, incluindo as glicoproteínas virais dos vírus Envelopado e das proteínas virais do capsídeo dos vírus não-envelopado, usando o computacional Algoritmos. Isso ajuda a identificar os alvos mecanisticamente do modo de ação da droga e fornecer informações úteis que podem ser mais validadas por ensaios a jusante.

Recentemente, empregou-se os métodos descritos acima para identificar compostos antivirais que bloquearam eficientemente a infecção pelos não-envoltos CVA169. Nisto, os protocolos detalhados que foram usados são descritos e discutidos.

Protocol

Nota: Todas as infecções da cultura e do vírus de pilha devem ser conduzidas em capas certificadas da Biossegurança que são apropriadas para o nível da biossegurança das amostras que estão sendo tratadas. As duas classes de Tanina de pequenas moléculas de Ácido Chebulágico (CHLA) e punicalagina (PUG), que foram observadas para bloquear eficientemente a infecção por CVA169, são usadas como exemplos de agentes inibitórios candidatos. Para princípios básicos em técn…

Representative Results

O teste de adição de tempo de fármaco é indicado na Figura 1 e mostra a influência do tratamento usando as pequenas moléculas CHLA e Pug na infecção CVA16 ou entrada pré-viral (pré-tratamento), durante a entrada viral (coadição), ou entrada pós-viral ( pós-infeção). Ambas as pequenas moléculas produziram apenas impacto marginal contra a infectividade do CVA16, seja no pré-tratamento das células hospedeiras antes da infecção viral (<strong…

Discussion

Neste relato, foram descritos os protocolos que são úteis para a identificação de candidatos antivirais que visam a entrada viral, em particular contra os não CVA16. Os ensaios são projetados de forma a dissecar os acontecimentos precoces durante a entrada viral, o que é útil para esclarecer o mecanismo (s) de ação e potencial alvo (s) da atividade antiviral dos agentes de teste. O “teste de tempo de adição de drogas” permite determinar amplamente o potencial alvo dos compostos de teste, por exemplo, as célu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores são gratos ao Dr. Joshua Beckham na Universidade de Texas em Austin para o apoio técnico com encaixe molecular. Este estudo foi parcialmente apoiado pelo financiamento do Ministério da ciência e tecnologia de Taiwan (MOST107-2320-B-037-002 para C.-JL e L.-T.L.; MOST106-2320-B-038-021 e MOST107-2320-B-038-034-MY3 a L.-T.L.).

Materials

4% Paraformaldehyde Sigma AL-158127-500G
Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG Invitrogen A11029
Amphotericin B GIBCO 15290-018
Anti-VP1 antibody Merck-Millipore MAB979 Anti-Enterovirus 71 Antibody, cross-reacts with Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D
Beckman Coulter Cytometer Beckman Coulter FC500
Corina Molecular Networks GmbH
Crystal violet Sigma C3886-100G
DMEM GIBCO 11995-040
DMSO Sigma D5879
FBS GIBCO 26140-079
Formaldehyde Sigma F8775
Graphpad Prism GraphPad
Heparin sodium salt Sigma H3393
In vitro toxicology assay kit, XTT-based Sigma TOX2
Methylcellulose Sigma M0512-100G
PBS pH 7.4 GIBCO 10010023
Penicillin-Streptomycin GIBCO 15070-063
PyMol Schrödinger
UCSF Chimera University of California, San Francisco

References

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Wang, J. Y., Lin, C., Liu, C., Lin, L. Use of Viral Entry Assays and Molecular Docking Analysis for the Identification of Antiviral Candidates against Coxsackievirus A16. J. Vis. Exp. (149), e59920, doi:10.3791/59920 (2019).

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