Summary

キメラ抗原受容体(CAR)T細胞の養子免疫療法用

Published: December 17, 2019
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Summary

キメラ抗原受容体(CAR)T細胞を確実に生成し、その分化と機能をインビトロとインビボでテストするアプローチについて説明します。

Abstract

養子免疫療法は、癌および感染症の治療のための約束を保持します。キメラ抗原受容体(CAR)で原発性ヒトT細胞を転行し、子孫ex生体内を拡張する簡単なアプローチについて説明します。CAR発現を測定するアッセイと、分化、増殖能力、細胞溶解活性を測定します。CAR T細胞におけるエフェクターサイトカイン産生および炎症性サイトカイン分泌を測定するアッセイについて説明する。当社のアプローチは、養子免疫療法の前臨床モデルのためのCAR T細胞を培養するための信頼性の高い包括的な方法を提供します。

Introduction

キメラ抗原受容体(CAL)は、T細胞を異なる腫瘍抗原に対してリダイレクトする有望なアプローチを提供する。CARは抗原標的に結合する合成受容体である。正確な構成は可変ですが、CAL には通常 3 つの異なるドメインが含まれています。細胞外ドメインは、標的抗原への結合を指示し、典型的には、細胞外ヒンジを介してCARに連結された単一鎖抗体断片から構成される。第2のドメインは、一般的にT細胞受容体(TCR)複合体のCD3度鎖に由来し、CAR関与に続いてT細胞活性化を促進する。第3の共刺激ドメインは、T細胞機能、生着、代謝、および持続性を増強するために含まれる。B細胞急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性リンパ球性白血病(CLL)および多発性骨髄腫を含む種々の造血悪性腫瘍におけるCAR T細胞療法の成功は、このアプローチの治療上の約束強調する1、2、3、4、5、6である。最近の食品医薬品局(FDA)の2つのCD19特異的CAR T細胞療法の承認は、小児および若年成人ALLのためのチザゲンレクリューセルおよびびまん性大細胞リンパ腫のためのアクシキャブタジーンシロロイセルであり、CAR T細胞療法の翻訳上のメリットを強化する。

CAR Tベースのアプローチは、末梢血からのT細胞の単離、活性化、遺伝子組換え、および拡張ex生体内を含む。分化はCAR T細胞の有効性を調節する重要なパラメータである。したがって、ex vivo培養中にT細胞分化を制限することは、注入された生成物が生着、拡大、および持続する能力を高め、養子移送2、7、8、9に続く長期免疫サーベイランスを提供する。T細胞は、ナイーブT細胞(Tn)、中央メモリ(Tcm)、エフェクターメモリ(Tem)、エフェクター分化(Tte)および幹細胞メモリ(Tscm)を含むいくつかの異なるサブセットで構成されています。エフェクター分化T細胞は強力な細胞溶解能を有する;しかし、彼らは短命であり、貧しい10、11、12を生み出します。対照的に、ナイーブT細胞およびTcmを含むあまり分化していない表現型を有するT細胞は、養子細胞移動13、14、15、16、18に続く優れた生着および増殖能力を示す。前製造された製品で収集されたT細胞の組成は、患者間で変化し得るし、CAR T細胞の治療可能性と相関する。開始アフェレシス産物におけるナイーブ様免疫フェノータイプを有するT細胞の割合は、生着および臨床応答19の両方と非常に相関している。

培養持続時間は、養子転法のために調製されたCAR T細胞における分化に影響を及ぼす重要なパラメータである。我々は最近、略培養パラダイム20を用いて優れた品質のCAR T細胞を生成するアプローチを開発した。我々のアプローチを用いて、限られた培養が優れたエフェクター機能を有するCAR T細胞を生じ、白血病の異種移植片モデルにおける養子移入に続く持続性を生み出すことを示した。ここでは、CART19細胞(CD3級および4-1BBシグナル伝達ドメインに付着した抗CD19 scFvを発現するように設計された自己T細胞)を確実に生成するアプローチを提示し、採用転写前のCAR Tの生理活性および有効性に関する洞察を提供するアッセイの詳細な説明を含む。

Protocol

すべての動物研究は、ペンシルベニア大学の制度的動物ケアと使用委員会によって承認されています. 1. T細胞の活性化、伝達、拡張 6ウェル細胞培養皿のT細胞あたり3ビーズの割合で抗CD3/CD28磁気ビーズ(例えば、ダイナビーズ)と混合することにより、新鮮または凍結保存された一次ヒトT細胞を活性化します。X-VIVO 15培地中の培養T細胞は、5%正常ヒトAB血清、2mM L-グ…

Representative Results

上記の方法を用いて、3日間または9日間T細胞を刺激し、拡張した(図1A,B)。また、図1Cに概説したゲーティング戦略で示されているように、細胞表面に発現する糖タンパク質の存在量を測定して、その分化プロファイルを解析した。ex vivo 培養中の経時のエフェクター分化に向けた進歩的なシフトを示す(図1</s…

Discussion

ここでは、ex vivo培養を通じて様々な間隔で採取したCAR T細胞の機能と有効性を測定するアプローチについて説明します。当社の方法は、増殖能力とインビトロでのエフェクター機能を評価するように設計されたアッセイに関する包括的な洞察を提供します。3日目から9日目に採取したCAR T細胞を用いたCARおよび白血病の異種移植片モデルを介したCARおよび詳細異種移植モデルを介してCAR T細胞?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、ペンシルベニア大学(マイケル・C・ミローン)やセント・ボールドリック財団奨学生賞(サバ・ガセミ)との研究アライアンスを通じて、ノバルティス・ファーマシューティカルズが提供する資金を通じて一部支援されました。

Materials

Anti CD3/CD28 dynabeads Thermo Fisher 40203D
APC Mouse Anti-Human CD8 BD Biosciences 555369 RRID:AB_398595
APC-H7 Mouse anti-Human CD8 Antibody BD Biosciences 560179 RRID:AB_1645481
BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate BD Biosciences 349202
BD Trucount Absolute Counting Tubes BD Biosciences 340334
Brilliant Violet 510 anti-human CD4 Antibody BioLegend 317444 RRID:AB_2561866
Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody BioLegend 317322 RRID:AB_2561911
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit Life Technolohgies C34554
CountBright Absolute Counting Beads, Invitrogen C36950
FITC anti-Human CD197 (CCR7) Antibody BD Pharmingen 561271 RRID:AB_10561679
FITC Mouse Anti-Human CD4 BD Biosciences 555346 RRID:AB_395751
HEPES Gibco 15630-080
Human AB serum Valley Biomedical HP1022
Human IL-2 IS, premium grade Miltenyi 130-097-744
L-glutamine Gibco 28030-081
Liquid scintillation counter, MicroBeta trilux Perkin Elmer
LIVE/DEAD Fixable Violet Molecular Probes L34964
Multisizer Coulter Counter Beckman Coulter
Na251CrO4 Perkin Elmer NEZ030S001MC
Pacific Blue anti-human CD14 Antibody BioLegend 325616 RRID:AB_830689
Pacific Blue anti-human CD19 Antibody BioLegend 302223
PE anti-human CD45RO Antibody BD Biosciences 555493 RRID:AB_395884
PE/Cy5 anti-human CD95 (Fas) Antibody BioLegend 305610 RRID:AB_493652
PE/Cy7 anti-human CD27 Antibody Beckman Coulter A54823
Phenol red-free medium Gibco 10373-017
UltraPure SDS Solution, 10% Invitrogen 15553027
Via-Probe BD Biosciences 555815
X-VIVO 15 Gibco 04-418Q
XenoLight D-Luciferin – K+ Salt Perkin Elmer 122799

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Cite This Article
Ghassemi, S., Milone, M. C. Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy. J. Vis. Exp. (154), e59949, doi:10.3791/59949 (2019).

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