Aislamiento, transfección y cultivo de monocitos humanos primarios
Summary
Aquí se presenta un protocolo optimizado para aislar, cultivar, transfectar y diferenciar a los monocitos primarios humanos de individuos infectados por el VIH y controles saludables.
Abstract
El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) sigue siendo un importante problema de salud a pesar de la introducción de la terapia antirretroviral combinada (CART) a mediados de la década de 1990. Si bien la terapia antirretroviral reduce eficientemente la carga viral sistémica y restaura el recuento normal de células CD4+ T, no reconstituye un sistema inmunitario completamente funcional. Un sistema inmunitario disfuncional en individuos infectados por el VIH sometidos a cART puede caracterizarse por activación inmune, envejecimiento temprano de las células inmunitarias o inflamación persistente. Estas condiciones, junto con factores comorbilidadasociadoes con la infección por vih, añaden complejidad a la enfermedad, que no se puede reproducir fácilmente en modelos celulares y animales. Para investigar los eventos moleculares subyacentes a la disfunción inmune en estos pacientes, aquí se presenta un sistema para cultivar y manipular monocitos primarios humanos in vitro. Específicamente, el protocolo permite el cultivo y la transfección de CD14primarios + monocitos obtenidos de individuos infectados por el VIH sometidos a cART, así como de controles VIH-negativos. El método implica aislamiento, cultivo y transfección de monocitos y macrófagos derivados de monocitos. Mientras que se emplean kits y reactivos disponibles en el término comercial, el protocolo proporciona consejos importantes y condiciones optimizadas para la adherencia exitosa y la transfección de monocitos con imitaciones e inhibidores de miRNA, así como con siRNAs.
Introduction
La infección por el virus de la inmunodeficiencia humana-1 (VIH-1) causa disfunción inmune grave, que puede conducir a infecciones oportunistas y síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Aunque los pacientes infectados por el VIH sometidos a cART se caracterizan por bajas cargas virales y recuentos normales de células CD4+ T, el funcionamiento del sistema inmunitario puede verse comprometido en estos individuos, lo que conduce a una respuesta inmune disfuncional que se ha relacionado con un mayor riesgo de desarrollar cáncer1. Los mecanismos de disfunción inmunitaria en pacientes con VIH en el cART siguen siendo en gran medida desconocidos. Por lo tanto, caracterizar las células inmunitarias derivadas del paciente e investigar su biología y función es un componente crítico de la investigación actual sobre el VIH.
Los monocitos y macrófagos son reguladores clave de las respuestas inmunitarias y desempeñan un papel fundamental en la infección por VIH2,3,4,5. De naturaleza heterogénea y plástica, los macrófagos pueden clasificarse ampliamente en activados clásicamente (M1) o activados alternativamente (M2). Si bien esta clasificación general es necesaria al establecer condiciones experimentales, el estado de polarización de los macrófagos puede ser invertido por una variedad de citoquinas6,7,8,9. Aunque varios estudios han investigado los efectos de la infección por VIH en monocitos y células dendríticas, los detalles moleculares de las respuestas mediadas por monocitos son en gran medida desconocidos6,7,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Entre los factores involucrados en la regulación y función de las células inmunitarias, se ha demostrado que los microARN (miRNAs), los ARN cortos no codificantes que regulan la expresión génica posttranscripción, desempeñan un papel importante en el contexto de las principales vías celulares (es decir, crecimiento, diferenciación, desarrollo y apoptosis)20. Estas moléculas han sido descritas como reguladores importantes de los factores de transcripción esenciales para dictar la polarización funcional de los macrófagos21. Se ha investigado el papel potencial de los miRNAs en los monocitos de personas infectadas por el VIH que se someten a cART, pero el progreso en el campo requiere mucho más trabajo22,23,24,25,26. Este artículo analiza un método optimizado para transfectar miRNAs y siRNAs en monocitos humanos primarios de pacientes y controles infectados por el VIH.
Este protocolo se basa en reactivos y kits disponibles comercialmente, ya que la continuidad en el procedimiento técnico ayuda a eliminar variables experimentales innecesarias cuando se trabaja con muestras clínicas. Sin embargo, el método proporciona consejos importantes (es decir, el número de células chapadas o una incubación breve con medios libres de suero para promover la adherencia de las células a la placa). Además, las condiciones de polarización utilizadas en este protocolo se derivan de la obra publicada27,28,29.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo presentado demuestra el uso de células primarias de sujetos infectados por el VIH como modelo para estudiar monocitos y macrófagos. VIH+ pacientes sometidos a cART viven con infección durante varios años y también pueden tener otras coinfecciones relacionadas con un sistema inmunitario comprometido. Para estudiar la inmunomodulación en presencia de infección crónica por VIH, las células se extraían directamente de los pacientes. Como se ha demostrado que los miRNAs desempeñan un papel i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer al núcleo de biorepositorio clínico/tumor de VIH por proporcionar muestras de pacientes y el núcleo de metabolismo de inmunología celular por proporcionar análisis de citometría de flujo. Este proyecto fue financiado por NIH P20GM121288 y P30GM114732.
Materials
| 0.5M EDTA | Invitrogen | AM9260G | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 366643 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD Horizon | 563794 | Flow cytometry |
| CD14 PerCP | Invitrogen | 46-0149-42 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD163 BV711 | BD Horizon | 563889 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD209 BV421 | BD Horizon | 564127 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD80 FITC | BD Horizon | 557226 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD83 APC | BD Horizon | 551073 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| Easy 50 EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18002 | |
| Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19669 | |
| EIF4EBP1 mAb | Cell Signaling | 9644 | Monoclonal antibody for Western blot |
| EIF4EBP1 siRNA | Santa Cruz | sc-29594 | |
| Fetal Bovin Serum Defined Heat Inactivated | Hyclone | SH30070.03HI | |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter | B43618 | |
| GAPDH mAb | Santa Cruz | SC-47724 | Monoclonal antibody for Western blot |
| HuFcR Binding Inhibitor | eBiosciences | 14-9161-73 | Flow cytometry- blocking buffer |
| Kaluza Analysis Software | Beckman Coulter | B16406 | Software to analyze flow cytometry data |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5 | Sigma | L4524 | |
| miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5p | Qiagen | YM00472124 | |
| MISSION miRNA Negative Control | Sigma | HMC0002 | Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye |
| Nunc 35mm Cell Culture Dish | Thermo Scientific | 150318 | |
| PBS | Gibco | 20012027 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Recombinant Human GM-CSF | R&D Systems | 215-GM-050 | |
| Recombinant Human IFN-γ | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| Recombinant Human IL-4 | R&D Systems | 204-IL-010 | |
| Recombinant Human M-CSF | R&D Systems | 216-MC-025 | |
| RPMI 1640 with L-Glutamine | Corning | 10040CVMP | |
| Scrambled Control siRNA | Santa Cruz | sc-37007 | |
| Viromer Blue Transfection Reagent Kit | Lipocalyx | VB-01LB-01 | |
| WST-1 Cell Proliferation Reagent | Roche | 5015944001 | Colorimetric assay to assess cell viability |
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