Summary

توليف أوليغوساكاريد ذو الوعاء الواحد الهرمي والقابل للبرمجة

Published: September 06, 2019
doi:

Summary

يوضح هذا البروتوكول كيفية استخدام برنامج Auto-CHO للتوليف الهرمي والقابل للبرمجة وعاء واحد من oligosaccharides. كما يصف الإجراء العام لتجارب تحديد RRV وغليكوزيل وعاء واحد من SSEA-4.

Abstract

تقدم هذه المقالة بروتوكول تجريبي عام لتوليف oligosaccharide وعاء واحد للبرمجة ويوضح كيفية استخدام برنامج Auto-CHO لتوليد الحلول الاصطناعية المحتملة. تم تصميم نهج التوليف oligosaccharide وعاء واحد للبرمجة لتمكين توليف oligosaccharide سريع من كميات كبيرة باستخدام كتل البناء ثيوغليكوزيد (BBLs) مع الترتيب التسلسلي المناسب لقيم التفاعل النسبي (RRVs). Auto-CHO هو برنامج عبر منصة مع واجهة المستخدم الرسومية التي توفر الحلول الاصطناعية الممكنة للبرمجة واحد وعاء oligosaccharide التوليف عن طريق البحث في مكتبة BBL (تحتوي على حوالي 150 التحقق من صحة و > 50،000 BBLs الظاهري) مع توقع بدقة RRVs من خلال دعم الانحدار ناقلات. تم تنفيذ خوارزمية التوليف الهرمي وعاء واحد في Auto-CHO ويستخدم الشظايا التي تم إنشاؤها بواسطة ردود الفعل وعاء واحد كBBLs جديدة. وبالإضافة إلى ذلك، يسمح Auto-CHO للمستخدمين بإعطاء ملاحظات لBBLs الظاهري للحفاظ على تلك القيمة لمزيد من الاستخدام. ويتجلى في هذا العمل تركيب وعاء واحد للمستضد الجنيني الخاص بالمرحلة 4 (SSEA-4)، وهو علامة متعددة القوى للخلايا الجذعية الجنينية البشرية.

Introduction

الكربوهيدرات هي في كل مكان في الطبيعة1،2، ولكن وجودها وطريقة العمل لا تزال منطقة مجهولة ، ويرجع ذلك أساسا إلى صعوبة الوصول إلى هذه الفئة من الجزيئات3. على عكس التوليف الآلي للoligopeptides وoligonucleotides، لا يزال تطوير التوليف الآلي للoligosaccharides مهمة هائلة، وكان التقدم بطيئا نسبيا.

لمعالجة هذه المشكلة، وضعت وونغ وآخرون أول طريقة آلية لتركيب oligosaccharides باستخدام برنامج برنامج للبرمجة يسمى Optimer4، والذي يوجه اختيار BBLs من مكتبة من ~ 50 BBLs لتسلسل وعاء واحد ردود الفعل. تم تصميم كل BBL وتوليفها مع التفاعل محددة جيدا ضبطها من قبل مختلف مجموعات الحماية. وباستخدام هذا النهج، يمكن التقليل إلى أدنى حد من تعقيدات حماية التلاعب والتنقية الوسيطة أثناء التوليف، التي اعتبرت أصعب المسائل التي ينبغي التغلب عليها في تطوير التوليف الآلي. على الرغم من هذا التقدم، لا تزال الطريقة مقيدة جدا، كما أن عدد BBLs صغيرة جدا وبرنامج Optimer يمكن فقط التعامل مع بعض oligosaccharides الصغيرة. لمزيد من القلة المعقدة التي تتطلب المزيد من BBLs ويمر متعددة من ردود الفعل وعاء واحد وتكاثف جزء، وقد تم تطوير نسخة مطورة من البرنامج، لصناعة السيارات في CHO.

في Auto-CHO، تمت إضافة أكثر من 50,000 BBLs مع تفاعل محدد إلى مكتبة BBL، بما في ذلك 154 الاصطناعية و 50,000 منها الظاهري. تم تصميم هذه BBLs من قبل التعلم الآلي على أساس الخصائص الأساسية، والتحولات الكيميائية NMR المحسوبةوالواصفات الجزيئيةوالتي تؤثر على هيكل وتفاعل BBLs. مع هذا البرنامج ترقية ومجموعة جديدة من BBLs المتاحة، يتم توسيع القدرة التوليفية، وكما هو مبين، يمكن إعداد العديد من oligosaccharides من الفائدة بسرعة. ويعتقد أن هذا التطور الجديد سوف يسهل تركيب oligosaccharides لدراسة أدوارهم في مختلف العمليات البيولوجية وآثارها على هياكل ووظائف البروتينات السكرية والدهون السكرية. ويعتقد أيضا أن هذا العمل سيعود بالفائدة على مجتمع العلوم السكرية بشكل كبير، بالنظر إلى أن هذه الطريقة متاحة لمجتمع البحوث مجانا. يتم تخليق علامة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية الأساسية، SSEA-45، في هذا العمل.

Protocol

1. لصناعة السيارات في CHO التلاعب البرمجيات تثبيت بيئة وقت تشغيل Java: تأكد من تثبيت بيئة وقت تشغيل Java (JRE) في الجهاز. إذا تم تثبيت JRE، انتقل إلى الخطوة التالية، “تهيئة البرامج”؛ خلاف ذلك، تحميل وتثبيت JRE وفقا لنظام التشغيل المستخدم وجدت في: . تهيئة البر…

Representative Results

تشير نتيجة البحث Auto-CHO استنادًا إلى إعدادات المعلمة الافتراضية إلى أن SSEA-4 يمكن توليفها بواسطة رد فعل [2 + 1 + 3] بوعاء واحد. يظهر الشكل 3 لقطة البرنامج من نتيجة البحث SSEA-4. عندما يتم تحديد trisaccharide الحد من نهاية مقبول(الشكل 3،التسمية 1)، يظهر البرنا…

Discussion

تم تطوير برنامج Auto-CHO لمساعدة الكيميائيين على المضي قدما في توليف وعاء واحد هرمية وقابلة للبرمجة من oligosaccharides5. تم بناء السيارات CHO من قبل لغة البرمجة جافا. بل هو برنامج واجهة المستخدم الرسومية وعبر منصة، والتي تدعم حاليا ويندوز، ماك، وأوبونتو. ويمكن تحميل البرنامج مجانا لموقع ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد دعم هذا العمل من قبل الأوساط الأكاديمية سينيكا بما في ذلك برنامج القمة، وزارة العلوم والتكنولوجيا [MOST 104-0210-01-09-02، MOST 105-0210-01-01، MOST 106-0210-01-15-02]، وNSF (1664283).

Materials

Acetonitrile Sigma-Aldrich 75-05-8
Anhydrous magnesium sulfate Sigma-Aldrich 7487-88-9
Cerium ammonium molybdate TCI C1794
Dichloromethane Sigma-Aldrich 75-09-2
Drierite Sigma-Aldrich 7778-18-9
Ethyl acetate Sigma-Aldrich 141-78-6
Methanol Sigma-Aldrich 67-56-1
Molecular sieves 4 Å Sigma-Aldrich
n-Hexane Sigma-Aldrich 110-54-3
N-Iodosuccinimide Sigma-Aldrich 516-12-1
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich 144-55-8
Sodium thiosulfate Sigma-Aldrich 10102-17-7
Toluene Sigma-Aldrich 108-88-3
Trifluoromethanesulfonic acid Sigma-Aldrich 1493-13-6

References

  1. Apweiler, R., Hermjakob, H., Sharon, N. On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database. Biochimica Et Biophysica Acta. 1473 (1), 4-8 (1999).
  2. Sears, P., Wong, C. -. H. Toward Automated Synthesis of Oligosaccharides and Glycoproteins. Science. 291 (5512), 2344-2350 (2001).
  3. Kulkarni, S. S., et al. “One-Pot” Protection, Glycosylation, and Protection-Glycosylation Strategies of Carbohydrates. Chemical Reviews. 118 (17), 8025-8104 (2018).
  4. Zhang, Z., et al. Programmable One-Pot Oligosaccharide Synthesis. Journal of the American Chemical Society. 121 (4), 734-753 (1999).
  5. Cheng, C. -. W., et al. Hierarchical and programmable one-pot synthesis of oligosaccharides. Nature Communications. 9 (1), 5202 (2018).
  6. . . ChemDraw. , (2019).
  7. Cheeseman, J. R., Frisch, &. #. 1. 9. 8. ;. . Predicting magnetic properties with chemdraw and gaussian. , (2000).
  8. Yap, C. W. PaDEL-descriptor: An open source software to calculate molecular descriptors and fingerprints. Journal of Computational Chemistry. 32 (7), 1466-1474 (2011).
  9. Ceroni, A., Dell, A., Haslam, S. M. The GlycanBuilder: a fast, intuitive and flexible software tool for building and displaying glycan structures. Source Code for Biology and Medicine. 2, 3 (2007).
  10. Damerell, D., et al. The GlycanBuilder and GlycoWorkbench glycoinformatics tools: updates and new developments. Biological Chemistry. 393 (11), 1357-1362 (2012).

Play Video

Cite This Article
Cheng, C., Zhou, Y., Pan, W., Dey, S., Wu, C., Hsu, W., Wong, C. Hierarchical and Programmable One-Pot Oligosaccharide Synthesis. J. Vis. Exp. (151), e59987, doi:10.3791/59987 (2019).

View Video