Summary

Litografía de haz de iones enfocado a etch nano-arquitecturas en microelectrodos

Published: January 19, 2020
doi:

Summary

Hemos demostrado que el grabado de nanoarquitectura en dispositivos de microelectrodos intracorticales puede reducir la respuesta inflamatoria y tiene el potencial de mejorar las grabaciones electrofisiológicas. Los métodos descritos aquí describen un enfoque de nanoarquitecturas de etch en la superficie de microelectrodos intracorticales de silicio de vástago único no funcionales y funcionales.

Abstract

Con los avances en electrónica y tecnología de fabricación, los microelectrodos intracorticales han experimentado mejoras sustanciales que permiten la producción de sofisticados microelectrodos con mayor resolución y capacidades ampliadas. El progreso en la tecnología de fabricación ha apoyado el desarrollo de electrodos biomiméticos, que tienen como objetivo integrarse perfectamente en el parénquima cerebral, reducir la respuesta neuroinflamatoria observada después de la inserción del electrodo y mejorar la calidad y longevidad de las grabaciones electrofisiológicas. Aquí describimos un protocolo para emplear un enfoque biomimético recientemente clasificado como nano-arquitectura. El uso de litografía de haz iónico focalizado (FIB) se utilizó en este protocolo para grabar características de nanoarquitectura específicas en la superficie de microelectrodos intracorticales de vástago único no funcionales y funcionales. La entrada en nanoarquitecturas en la superficie del electrodo indicó posibles mejoras de biocompatibilidad y funcionalidad del dispositivo implantado. Uno de los beneficios de utilizar FIB es la capacidad de grabar en dispositivos fabricados, a diferencia de durante la fabricación del dispositivo, facilitando posibilidades ilimitadas para modificar numerosos dispositivos médicos post-fabricación. El protocolo presentado en este documento se puede optimizar para varios tipos de materiales, características de nanoarquitectura y tipos de dispositivos. Aumentar la superficie de los dispositivos médicos implantados puede mejorar el rendimiento del dispositivo y la integración en el tejido.

Introduction

Los microelectrodos intracorticales (IME) son electrodos invasivos que proporcionan un medio de interconexión directa entre los dispositivos externos y las poblaciones neuronales dentro de la corteza cerebral1,2. Esta tecnología es una herramienta invaluable para registrar potenciales de acción neuronal para mejorar la capacidad de los científicos para explorar la función neuronal, avanzar en la comprensión de las enfermedades neurológicas y desarrollar terapias potenciales. El microelectrodo intracortical, utilizado como parte de los sistemas de interfaz de máquina cerebral (IMC), permite registrar potenciales de acción de un individuo o pequeños grupos de neuronas para detectar intenciones motoras que se pueden utilizar para producir salidas funcionales3. De hecho, los sistemas de IMC se han utilizado con éxito con fines protésicos y terapéuticos, como el control del ritmo sensorimotor adquirido para operar un cursor informático en pacientes con esclerosis lateral amiotrófica (ELA)4 y lesiones de la médula espinal5 y restaurar el movimiento en personas que sufren de tetraplejia crónica6.

Desafortunadamente, los IME a menudo no graban consistentemente con el tiempo debido a varios modos de falla que incluyen factores mecánicos, biológicos y materiales7,8. La respuesta neuroinflamatoria que se produce después de la implantación del electrodo se cree que es un reto considerable que contribuye a la falla del electrodo9,10,11,12,13,14. La respuesta neuroinflamatoria se inicia durante la inserción inicial del IME que corta la barrera hematoencefálica, daña el parénquima cerebral local y interrumpe las redes gliales y neuronales15,16. Esta respuesta aguda se caracteriza por la activación de células gliales (microglia/macrofagos y astrocitos), que liberan moléculas proinflamatorias y neurotóxicas alrededor del sitio del implante17,18,19,20. La activación crónica de las células gliales da lugar a una reacción del cuerpo extraño caracterizada por la formación de una cicatriz glial aislando el electrodo del tejido cerebral sano7,9,12,13,17,21,22. En última instancia, dificultando la capacidad del electrodo para registrar potenciales de acción neuronal, debido a la barrera física entre el electrodo y las neuronas y la degeneración y muerte de las neuronas23,24,25.

El fracaso temprano de los microelectrodos intracorticales ha llevado a cabo una considerable investigación en el desarrollo de electrodos de próxima generación, con énfasis en las estrategias biomiméticas26,27,28,29,30. De particular interés para el protocolo descrito aquí, es el uso de la nanoarquitectura como una clase de alteraciones biomiméticas de la superficie paraiME 31. Se ha establecido que las superficies que imitan la arquitectura del entorno natural in vivo tienen una respuesta biocompatible mejorada32,33,34,35,36. Por lo tanto, la hipótesis que obliga a este protocolo es que la discontinuidad entre la arquitectura áspera del tejido cerebral y la arquitectura lisa de los microelectrodos intracorticales puede contribuir a la respuesta neuroinflamatoria y crónica del cuerpo extraño a las IME implantadas (para una revisión completa se refieren a Kim et al.31). Hemos demostrado anteriormente que la utilización de características de nanoarquitectura similares a la arquitectura de matriz extracelular del cerebro reduce los marcadores inflamatorios de astrocitos de células cultivadas en sustratos nano-arquitecturados, en comparación con las superficies de control planas en modelos in vitro y ex vivo de neuroinflamación37,38. Además, hemos demostrado la aplicación de litografía de haz iónico focalizado (FIB) a nanoarquitecturas de grabado directamente en sondas de silicio dio lugar a un aumento significativo de la viabilidad neuronal y una menor expresión de genes proinflamatorios de animales implantados con las sondas de nanoarquitectura en comparación con el grupo de control suave26. Por lo tanto, el propósito del protocolo presentado aquí es describir el uso de la litografía FIB para grabar nanoarquitecturas en dispositivos de microelectrodos intracorticales fabricados. Este protocolo fue diseñado para grabar características de tamaño nano-arquitectura en superficies de silicio de vástagos de microelectrodos intracorticales utilizando procesos automatizados y manuales. Estos métodos son sencillos, reproducibles y, sin duda, se pueden optimizar para diversos materiales de dispositivos y tamaños de características deseados.

Protocol

NOTA: Realice los siguientes pasos mientras usa el equipo de protección personal adecuado, como una capa de laboratorio y guantes. 1. Montaje de la sonda de silicio no funcional para la litografía del haz de iones focalizado (FIB) NOTA: Para el procedimiento completo que describe la fabricación de la oblea SOI con las 1.000 sondas, consulte Ereifej et al.39. Aísle una tira de 2-3 sondas de silicio del silicio en la oblea aislant…

Representative Results

FIB Grabado Nano-arquitectura en las superficies de las sondas intracorticales de un solo vástagoUtilizando los métodos descritos aquí, las sondas intracorticales fueron grabadas con nanoarquitecturas específicas siguiendo los protocolos establecidos39. Las dimensiones y la forma del diseño de nanoarquitectura descrito en estos métodos se implementaron a partir de resultados in vitro anteriores que representan una disminución en la reactividad de las células gliales cu…

Discussion

El protocolo de fabricación descrito aquí utiliza litografía de haz iónico focalizado para grabar de manera efectiva y reproducible nanoarquitecturas en la superficie de microelectrodos de silicio de un solo vástago no funcionales y funcionales. La litografía de haz iónico focalizado (FIB) permite la ablación selectiva de la superficie del sustrato mediante el uso de un haz de iones finamente enfocado50,51. FIB es una técnica de escritura directa que pue…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudio fue apoyado por los premios del Servicio de Investigación y Desarrollo de Rehabilitación de Asuntos de Veteranos de los Estados Unidos (EE.UU.): #RX001664-01A1 (CDA-1, Ereifej) y #RX002628-01A1 (CDA-2, Ereifej). El contenido no representa las opiniones del Departamento de Asuntos de Veteranos de los Estados Unidos ni del Gobierno de los Estados Unidos. Los autores desean agradecer a FEI Co. (Ahora parte de Thermofisher Scientific) por la asistencia del personal y el uso de la instrumentación, que ayudó en el desarrollo de los guiones utilizados en esta investigación.

Materials

16-Channel ZIF-Clip Headstage Tucker Davis Technologies ZC16 The headstage and headstage holder may need to be changed, depending on the electrode used. https://www.tdt.com/zif-clip-digital-headstages.html
1-meter cable, ALL spring wrapped Thomas Scientific 1213F04 Any non treated petri dish will suffice. https://www.thomassci.com/Laboratory-Supplies/Cell-Culture-Dishes/_/Non-Treated-Petri-Dishes?q=petri%20dish%20cell%20culture
32-Channel ZIF-Clip Headstage Holder Tucker Davis Technologies Z-ROD32 The headstage and headstage holder may need to be changed, depending on the electrode used. https://www.tdt.com/zif-clip-digital-headstages.html
Acetone, Thinner/Extender/Cleaner, 30ml Ted Pella 16023 https://www.tedpella.com/SEMmisc_html/SEMpaint.htm#anchor16062
Baby-Mixter Hemostat Fine Science Tools 13013-14 Any curved hemostat will suffice. https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Hemostats/Baby-Mixter-Hemostat
Carbon Conductive Tape, Double Coated Ted Pella 16084-7 The protocol suggested three options for mounting the functional electrode to the aluminum stub (copper or carbon conductive tape or a low profile clip. We utilized the carbon conductive tape in our study. https://www.tedpella.com/semmisc_html/semadhes.htm
Corning Costar Not Treated Multiple Well Plates – 6 well Sigma Aldrich CLS3736-100EA Any non-treated 6 well plate will suffice. https://www.sigmaaldrich.com/catalog/substance/
Dumont #5 Fine Forceps Fine Science Tools 11251-30 Either this fine forceps or the vacuum pump will suffice. https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Dumont-Forceps/Dumont-5-Forceps/11251-30
Ethanol, 190 proof (95%), USP, Decon Labs Fisher Scientific 22-032-600 Any 95% ethanol will suffice. https://www.fishersci.com/shop/products/ethanol-190-proof-95-usp-decon-labs-10/22032600
Falcon Cell Strainer Fisher Scientific 08-771-1 https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711
FEI, Tescan, Zeiss (also for Philips, Leo, Cambridge, Leica, CamScan), aluminum, grooved edge, Ø32mm Ted Pella 16148 Depending on the SEM machine used, you may need a different size stub. https://www.tedpella.com/SEM_html/SEMpinmount.htm#_16180
Fisherbrand Aluminum Foil, Standard-gauge roll Fisher Scientific 01-213-101 Any aluminum foil will suffice. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-aluminum-foil-7/p-306250
Fisherbrand Low- and Tall-Form PTFE Evaporating Dishes Fisher Scientific 02-617-149 Any Teflon plate will suffice, this is used to dry the probes after washing on a surface they will not stick onto. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-low-tall-form-ptfe-evaporating-dishes-12/p-88552
Michigan-style silicon functional electrode NeuroNexus A1x16-3mm-100-177 http://neuronexus.com/electrode-array/a1x16-3mm-100-177/
Model 1772 Universal holder KOPF Model 1772 Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-1772-universal-holder/
Model 900-U Small Animal Stereotaxic Instrument KOPF Model 900-U Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-900-small-animal-stereotaxic-instrument1/
Model 960 Electrode Manipulator with AP Slide Assembly KOPF Model 960 Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-1772-universal-holder/
Parafilm M 10cm x 76.2m (4" x 250') Ted Pella 807-5 https://www.tedpella.com/grids_html/807-2.htm
PELCO Vacuum Pick-Up System, 220V Ted Pella 520-1-220 Either this vacuum pump or the fine forceps will suffice. http://www.tedpella.com/grids_html/Vacuum-Pick-Up-Systems.htm#anchor-520
PELCO Conductive Silver Paint Ted Pella 16062 https://www.tedpella.com/SEMmisc_html/SEMpaint.htm#anchor16062
SEM FIB FEI Helios 650 Nanolab Thermo Fisher Scientific Helios G2 650 This is the specific focused ion beam and scanning electron microscope used in the protocol. The Nanobuilder software is what it comes with. If a different FIB instrument is used, it may not be completely compatible with the protocol, specifically the steps requiring the Nanobuilder software. https://www.fei.com/products/dualbeam/helios-nanolab/

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Cite This Article
Mahajan, S., Sharkins, J. A., Hunter, A. H., Avishai, A., Ereifej, E. S. Focused Ion Beam Lithography to Etch Nano-architectures into Microelectrodes. J. Vis. Exp. (155), e60004, doi:10.3791/60004 (2020).

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