電子顕微鏡検査用胚、卵殻、真菌培養の処理

Summary

ここでは、走査電子顕微鏡(SEM)を用いて繊細な組織サンプルをイメージングするための詳細な処理プロトコルを紹介する。すなわち、ヘキサメチル・ジシラザナ(HMDS)化学乾燥、単純な空気乾燥、および臨界点乾燥の3つの異なる処理方法が、硬質卵殻、初期発達段階における胚、および真菌培養物をそれぞれ調製するために記載されている。

Abstract

走査型電子顕微鏡(SEM)は、様々な生物学的および非生物学的サンプルの超構造解析に広く使用されていますが、異なる生物学的サンプルの処理に関与する方法には独自の手法が含まれます。サンプルを処理するための文献に記載されているすべての従来の慣行は、まだ有用なアプリケーションを見つけるが、サンプル準備の微妙な変更は、画像の品質を変更することができますだけでなく、アーティファクトを導入します。したがって、分析された組織の種類に特有のユニークなサンプル調製技術を使用して、超構造分解能を持つ良好な品質の画像を得るために必要とされる。本研究の焦点は、SEMを用いて胚、硬質卵殻、真菌培養物をイメージングするための最適なサンプル調製プロトコルを提供することにある。以下の最適化は、研究された3つの異なる繊細な生物学的サンプルに対して良好な結果を得るために推奨された。4%パラホルムアルデヒドまたは3%グルタルアルデヒドのような穏やかな固定剤の使用に続いて、エタノールシリーズで脱水が必須です。スライド培養物によって得られた寒天ブロック上の真菌菌糸体は、寒天プレートから直接採取された培養物と比較して、より優れた超構造性を生み出します。HMDSを使用した胚の化学乾燥は、臨界点乾燥と比較して表面張力アーティファクトを導入することなく乾燥を提供します。HMDSは、サンプルが乾燥中に脆くならないため、収縮によるひび割れを防ぎます。しかし、真菌培養の場合、クリティカルポイント乾燥は化学乾燥に比べて許容可能な画質を提供します。卵殻は取付け前に徹底的な洗浄および空気乾燥を除いて特別な準備ステップなしでイメージすることができる。調製方法論は、各試験で得られた許容可能な画質に基づいて標準化された。

Introduction

走査型電子顕微鏡(SEM)超構造解析および細胞内イメージングサプリメントは、原核生物、植物、動物の3次元プロファイリングのための光顕微鏡を補完する。SEMの高い空間分解能は、ナノメートルからマイクロメートルスケールの標本の微細構造特性の検査に利用できる最も汎用性の高い強力な技術の1つになります。乾燥した標本は、機能的関係1、2、3に関する有効な結論を開発するための基礎を提供する強烈な詳細を持つ組成および地形構造に解決される^{,4,5,6,7,8,9.}生物標本のSEM画像を解釈する場合、処理中に作成された天然構造とアーティファクトを区別することは大きな課題です。SEMは、一般に、試料10、11から放出される一次、二次または逆散乱電子ビームに影響を与えるガス分子からの干渉を避けるために、非常^に高い真空で作動する。また、生物材料は、その不十分または非伝導性による放射線損傷の影響を受けやすい。SEMに積み込まれた試料は、完全に乾燥し、任意の有機汚染物質を含まないことが不可欠です^10,11.生物標本は主に水で構成されているので、ネイティブ構造が保持されるように追加の準備技術が必要です。

得られる分解能は、利用される試料の種類および器械の変数に特有の調製方法を最適化することに基づいている。したがって、すべての組織タイプに対して一般化された処理ステップを使用することを避ける必要がある。一部の生物標本は、構造を維持するためにより厳格な処理を必要とし、収縮や崩壊などの乾燥アーティファクトの導入を避けるために、繊細な種類のサンプルにはより多くの時間と注意が必要になる場合があります。サンプル調製は、SEMイメージングにおける重要なステップです。形態学的研究の所見は、検体調製手順12,13によって著しく影響を受ける。多くの生物学的サンプルの一般的な調製工程は、表面をSEM分析用に導電性に変換するために、金、白金、パラジウムなどの金属を用いて固定、脱水、コーティングを行います。使用されるステップの性質と組み合わせは、組織の種類、および研究の具体的な目標によって異なります。電荷の蓄積、真空および電子ビーム損傷に対する感度は、柔らかい繊細な生物学的サンプルを処理する際に問題を引き起こす、物体のネイティブ構造を保持するために追加の処理ステップを必要とする。四酸化オスミウム固定などの従来の方法を使用して、脱水は収縮および繊細な組織の崩壊を引き起こす^14,15,16,17.この研究の目的は、以前の研究からのアイデアと、柔らかい繊細な組織(爬虫類の胚、塗装されたカメの卵殻、真菌培養物)を準備し、画像化するための修正と組み合わせることによって導き出されたエレガントな方法論を確立することです。

適切な固定方法の選択は、生物標本の顕微鏡分析のための最初の最も重要なステップです。分解による形態の変化を防ぐためには、生物から分離した直後に組織を固定することが不可欠です。効果的な固定剤は、細胞を迅速に浸透させ、その後の処理ステップとSEM¹⁷の下での検査の両方に耐えるためにサンプルの構造を安定させるために不可逆的に効果を維持することによって細胞プロセスを終了する必要があります^,18.いくつかの化学的および物理的な固定方法が知られているが、化学的固定は、自己解動、腐敗、および乾燥効果による細胞変化を避けるために、生物標本のためにより一般的に使用される。文献17、19、20、21、22、23、変性によって働く固定剤で議論される多数の固定化学製剤があり、生体高分子を凝固させ、高分子を共生して固定するもの。アルコールは、超構造を非常に不十分に保存する変性固定剤として使用され、主に光顕微鏡検査に使用され、電子顕微鏡分析には推奨されません。ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、四酸化オスミウムなどの架橋固定剤は、組織内の高分子間に分子間および分子内架橋を作成し、超構造の優れた保存を提供^{する11 ,24,25,26}.生物学的サンプルは温度に敏感です。固定の開始時の温度は、膜タンパク質の横移動性を低下させ、細胞間分子の拡散を遅くし、^固定11の速度を遅くするために4°Cであることが推奨される。組織の固定に必要な時間は、サンプルのサイズと固定性が拡散し、試料の成分と反応する速度に大きく依存します。4°CでPBSで4%パラホルムアルデヒドまたは3%グルタルアルデヒドの一晩固定は、より小さな繊細なサンプルを処理することを可能にする順次浸透特性のために本研究で使用される標本のSEM分析のための好ましい方法です^{17,18歳,19歳,20歳,27.}四酸化オスミウムとのポスト固定ステップは、その有毒性のためだけでなく、この研究で分析されたサンプルの画質を向上させる追加の利点を実装しないことが判明しました。

生物学的サンプルには、SEM操作を妨げる流体が含まれています。したがって、サンプルは、SEMサンプルチャンバに挿入する前に乾燥する必要があります。脱水が確実に行われるようになると、表面張力/乾燥のために試料にアーティファクトを作り出さずに溶媒を組織から除去する必要があります。SEMイメージングの処理組織の間に3つの異なる乾燥方法が一般的に使用されました:空気乾燥、臨界点乾燥、および凍結乾燥サンプル28、29、30、31。いくつかの研究は、動物組織サンプル28、29、30、31と同じ結果を生成するすべての3つの乾燥方法を報告します。より小さい標本に用いられる一般的な慣行は、アルコールおよびヘキサメチルジラザン(HMDS)の濃度シリーズを上昇させることによって化学的脱水であるが、より大きい標本は臨界点乾燥(CPD)器^械32を使用して乾燥される。乾燥プロセス中に、液体/ガス界面によって試料を通過する小さな空洞で形成されるかなりの力;これは、中空^構造33の完全な崩壊につながる可能性さえあります.処理によって発生する変形は、その後、試料のネイティブ構造特徴と誤解される可能性があります。したがって、処理のための一般化された現象を排除し、特に繊細な組織標本を分析する場合は、組織の種類ごとに独自の乾燥プロセスを標準化する必要があります。

上記のすべてのプロセスの様々な組み合わせを用いて行われたいくつかの試験では、爬虫類胚、塗装カメの卵殻、真菌培養の3つの繊細な組織のSEM分析に使用できる方法を標準化しました。発達生物学者と形態学者は、代表的な脊椎動物における胚発生時の正常および異常な形態形成について説明する。遺伝子シグナル伝達経路の調査は、新しい構造の形態学的記述に依存する。SEM解析中に脊椎動物の胚構造が急激に変化するのを防ぐために、脱水後の化学乾燥をお勧めします。HMDSを使用した化学乾燥は比較的新しい乾燥方法であり、相対的な速さ、使いやすさ、コストの損失、および必要な限られた専門知識と機器が含まれます9。CPDは、特定の温度および圧力で試料全体に通過CO2を使用して一般的に使用される乾燥技術です。我々は、HMDSが柔らかい繊細な組織を乾燥するのに適しており、胚組織に広範な変形を引き起こした臨界点乾燥と比較して、より大きなサンプルを処理することを可能にすることを同定した。^真菌34の形態学的特性を研究するためにSEMイメージングのためのサンプルを調造するためにいくつかの方法が使用されている。真菌標本は一般的に四酸化オスミウムで固定され、エタノール脱水と臨界点乾燥が続き、満足のいく結果をもたらす可能性があるが、四酸化オスミウム6、7、35の毒性作用は満足のいく結果をもたらす可能性がある。処理中に溶液を変更しながら真菌材料を失うことは顕著な欠点です。固定せずに空気乾燥を用いた試料調製技術^も36回実施されていますが、構造の縮小や崩壊が起き、種を特徴付けながら、このような試料の観察が誤解されやすい。真菌性ハイファは液体と接触してその完全性を失い、さらに乾燥は構造を復元するために達成されない場合があります。この効果のために、凍結乾燥は、真菌菌糸体のような軟部組織を乾燥させるために一般的に使用されます。凍結乾燥はきれいな材料のためにうまく機能しますが、塩や分泌物の存在は、SEMの視聴段階でのみ識別される表面の詳細を不明瞭にします。スライド培養法をグルタルアルデヒド固定と臨界点乾燥と結合し、無傷の真菌性菌性菌および胞子の構造的詳細を得た。CPD乾燥は胚の収縮を引き起こしたが、グルタルアルデヒド固定と相まって、よく保存された菌構造をもたらした。卵殻は、保護カバーとして機能するだけでなく、機械的安定性、ガスと水への透過性、および発達する胚のためのカルシウム予備を提供することによって、卵性動物の胚にとって最も重要です。淡水カメの卵殻は、その構造に基づいて「硬質」に分類され、その利用可能性のために生物学者1、2、3、4から大きな注目を集めています。^{,5,6,7,37歳,38}.

私たちは、任意の硬質卵殻種に適用することができる塗装カメの卵殻と殻膜の簡単な検査のための簡単な方法を詳述します。作成方法は、結果として得られる画質と潜在的なアーティファクトの減少に基づいて評価されました。

Protocol

注:この研究で使用されるペイントカメ(クリーセミースピクタ)卵は、ニューヨーク州環境省の許可を得て、ライスクリークフィールドステーション、オズウィーゴニューヨークから2015-6月のネスティングシーズン中に収集されました保全(DEC)。 1. SEM用胚を処理する化学乾燥法 ネストシーズン中にフィールドサイトからカメの卵を収集します。蓋付きプラス?…

Representative Results

図1は、塗装されたカメ(クリーセミースピクタ)胚の走査電子微量解析を示す。塗装されたカメの卵を寝具媒体上に集め、インキュベートし、化学乾燥後のアルミニウムスタブに取り付け、SEMイメージングに用いた(図1A-E)。ステージ12胚の横図は頭蓋骨の構造を示す;上顎の顕著さは顎骨を越えて広がり、よく印が付いている鼻の?…

Discussion

我々の研究では、異なる固定剤、脱水および乾燥方法を試験し、胚、卵殻、真菌培養物の3つの異なる繊細な生物学的サンプルを調べた。SEM は一般的にサーフェス解析に使用されるので、固定浸透はあまり関係ありませんが、固定性の低い内部構造は内側の縮小や崩壊の表面構造を引き起こすことを理解する必要があります。延長された固定時間はまた、固定期間に応じて数回固定溶液を置?…

Materials

Agar	Fischer Scientific	S25127A	for slide cultures
Aluminum pin stub	Tedpella	16111	12.7 mm x 8 mm
BD Difco Dehydrated Culture Media: Potato Dextrose Agar	BD 213400	DF0013-17-6	Media for isolation and cultivation of Fungi, yeast and molds
Chloramphenicol	Fischer BioReagents	BP904-100	Antibiotic for media
Coarse Vermiculite	Greenhouse Megastore	SO-VER-12	bedding medium
Clear 12- well plate	Corning	07-201-589	for fixing embryo
Coverslips	Fischer Scientific	S17525B	for slide culture
Critical Point Dryer	Quorum CPD	EMS850	critical point drying
Culture dishes	Fischer Scientific	08 747B	DISH PETRI 100X10MM 12/PK
Ethanol	Fischer Scientific	A406P 4	dehydration agent
Forceps- Aquarius Tweezers	Tedpella	5804	style 4, length 108mm, widh x thickness 0.017 x 0.17 mm
Glutaraldehyde	Fischer Scientific	G151-1	fixative
Gold target for sputter coater	DENTON VACUUM	TAR001-0158	Gold Target, 2.375″ D X .002″
Hexamethyldisilazana	Fischer Scientific	C19479-5000	chemical drying agent
Kim wipes	Kimtech	S-8115	cleaning
Microscope slides	Thermo Scientific	67-762-16	for slide culture
Microscopy Scissors	Tedpella	1327	Double pointed, stainless steel, 100 mm L (3-5/8").
Micro-scissors	Tedpella	1346	Vannas-type, straight, 80mm L
Moria Perforated Embryo Spoon	Fine Science Tools	10370-17	Length 14.5 cm, tip diameter 20 mm, spoon depth 5 mm
Netwell Inserts	Corning	0330B09	15 mm Inserts with 74 µm Mesh Size Polyester Membrane act as handy carriers during specimen processing into different solvents
Paraformaldehyde	Fischer Scientific	T353 500	fixative
Peat moss	Walmart- Miracle Gro	551705263	bedding medium
PELCO tabs double stick carbon conductive tape	Tedpella	5000	12 mm OD
Sputter coater	DENTON VACUUM	DESK V	thin metal coating
SEM	JEOL USA	JEOL JSM 6610LV scanning electron scope	electron microscopy