Summary

التمييز ورسم خرائط للنصوص الأولية والمجهزة في ميتوتشوندريون الذرة باستخدام استراتيجية دائرية تستند إلى RT-PCR

Published: July 29, 2019
doi:

Summary

نقدم استراتيجية دائرية تستند إلى RT-PCR من خلال الجمع بين التعميم RT-PCR، الكمية RT-PCR، RNA 5 ‘العلاج متعدد الفوسفات، ووصمة عار الشمالية. ويتضمن هذا البروتوكول خطوة تطبيع للتقليل إلى أدنى حد من تأثير ثلاثي الفوسفات غير المستقر 5’، وهو مناسب للتمييز ورسم خرائط للنصوص الأولية والمجهزة المتراكمة بشكل كبير في ميتوتشوندريون الذرة.

Abstract

في الميتوكوندريا النباتية، تحتوي بعض النصوص ذات الحالة الثابتة على 5’ثلاثي الفوسفات مشتق من بدء النسخ (النصوص الأولية)، في حين تحتوي النصوص الأخرى على 5’أحاديالفوسفات ولدت بعد النسخ (النصوص المجهزة). للتمييز بين هذين النوعين من النصوص، تم وضع العديد من الاستراتيجيات، ويعتمد معظمها على وجود/غياب ثلاثي الفوسفات 5…. ومع ذلك، فإن ثلاثي الفوسفات في المرحلة الابتدائية 5 ‘تيرميني غير مستقر، وأنه يعوق تمييز واضح من هذين النوعين من النصوص. للتمييز بشكل منهجي وخريطة النصوص الأولية والمجهزة المتراكمة بشكل كبير في ميتوشوندريون الذرة، قمنا بتطوير استراتيجية دائرية RT-PCR (cRT-PCR) القائمة على الجمع بين cRT-PCR، الحمض النووي الريبي 5 ‘علاج متعدد البوخباتازي، الكمية RT-PCR (RT-qPCR)، ووصمة عار الشمالية. كتحسين، وتشمل هذه الاستراتيجية خطوة تطبيع الحمض النووي الريبي للحد من تأثير غير مستقر 5 ‘ثلاثي الفوسفات.

في هذا البروتوكول، يتم معالجة الحمض النووي الميتوكوندريا المخصب مسبقا من قبل RNA 5 ‘polyphosphatase، الذي يحول 5 ‘triphsophate إلى أحادي الفوسفات. بعد التعميم والنسخ العكسي، يتم تطبيع اثنين من cDNAs المستمدة من 5 ‘متعدد الفوسفاتيز المعالجة وغير المعالجة RNAs من قبل الذرة 26S rRNA ناضجة، والتي لديها نهاية معالجة 5 ‘وغير حساسة ل5’polyphosphatase. وبعد التطبيع، يتم التمييز بين النصوص الأولية والمجهزة عن طريق مقارنة منتجات cRT-PCR وRT-qPCR التي تم الحصول عليها من التقييمات RNAs المعالجة وغير المعالجة. يتم تحديد termini النص عن طريق الاستنساخ وتسلسل منتجات cRT-PCR، ومن ثم التحقق من قبل وصمة عار الشمالية.

باستخدام هذه الاستراتيجية، تم تحديد معظم النصوص ثابتة الدولة في ميتوشوندريون الذرة. بسبب نمط النسخ المعقد لبعض الجينات الميتوكوندريا، لم يتم تمييز بعض النصوص الثابتة و/أو تعيينها، على الرغم من أنها تم اكتشافها في لطخة شمالية. نحن لسنا متأكدين ما إذا كانت هذه الاستراتيجية مناسبة للتمييز وخريطة النصوص ثابتة الحالة في الميتوكوندريا النباتية الأخرى أو في plastids.

Introduction

في الميتوكوندريا النباتية، يتم تجميع العديد من RNAs ناضجة والسلائف كما isoforms متعددة، ويمكن تقسيم النصوص ثابت الدولة إلى مجموعتين على أساس الفرق في نهايات ها 5‘1، 4. النصوص الأولية لها 5 ‘نهايات ثلاثي الفوسفات، والتي تستمد من بدء النسخ. وعلى النقيض من ذلك، فإن النصوص المجهزة تحتوي على 5’أحاديالفوسفات يتم إنشاؤها بواسطة المعالجة اللاحقة للنسخ. التمييز ورسم الخرائط من نوعين من النصوص مهمة لكشف الآليات الجزيئية الكامنة وراء النسخ والانتهاء من النضج النص.

وللتمييز بين النصوص الأولية والنصوص المجهزة في المتن النباتي، وضعت أربع استراتيجيات رئيسية. وتتمثل الاستراتيجية الأولى في المعالجة المسبقة لمضادات الأوجاع الميتوكوندريا بحمض التبغ البيروففاتيز (TAP)، الذي يحول الفوسفات الثلاثي الفوسفات إلى الفوسفات الأحادي الفوسفات ويمكّن النصوص الأولية من التعميم بواسطة الليغاسي الحمض النووي الريبي. ثم تتم مقارنة وفرة النسخ من عينات الحمض النووي الريبي المعالجة وغير المعالجة عن طريق التضخيم السريع لنهايات cDNA (RACE) أو التعميم RT-PCR (cRT-PCR)2،3،4. في الاستراتيجية الثانية، يتم استنفاد النصوص المجهزة أولا من RNAs الميتوكوندريا باستخدام المنهي 5′-الفوسفات تعتمد exonuclease (تكس)، ثم يتم تعيين النصوص الأولية اليسار عن طريق تحليل التمديد التمهيدي5،6 . الاستراتيجية الثالثة هي قبل سقف النصوص الأولية باستخدام guanylyl transferase، ومن ثم يتم تحديد موقف ثلاثي الفوسفات 5 ‘تيرميني عن طريق التمديدالتمهيدي جنبا إلى جنب مع ribonuclease أو S1 تحليل حماية nuclease 7،8 ،9. تختلف عن تلك التي تعتمد على وجود / عدم وجود 5 ‘ثلاثي الفوسفات، والاستراتيجية الرابعة يجمع في النسخ في المختبر، وmutagenesis الموجهة حسب الموقع، وتحليل التمديد التمهيدي لتوصيف المروجين المفترضة وتحديد النسخ بدءمواقع 8،10،11. باستخدام هذه الاستراتيجيات، تم تحديد العديد من النصوص الأولية والمجهزة في الميتوكوندريا النباتية.

ومع ذلك، فقد ذكرت العديد من الدراسات أن 5 ‘ثلاثي الفوسفات من النصوص الأوليةكانت غير مستقرة، وأنها تحولت بسهولة إلى أحادي الفوسفات لسبب غير معروف 2،12،13. وتعوق هذه المشكلة التمييز الواضح بين هذين النوعين من النصوص باستخدام تقنيات تبعاً لوجود/عدم وجود 5’ثلاثي الفوسفات، والجهود السابقة للتمييز المنهجي بين النصوص الأولية والمجهزة في المصنع فشل الميتوكوندريا2،12.

في هذا البروتوكول، ونحن الجمع بين cRT-PCR، RNA 5 ‘العلاج متعدد الفوسفات، RT-qPCR، ووصمة عار الشمالية للتمييز بشكل منهجي النصوص الأولية والمصنعة المتراكمة بشكل ملحوظ في الذرة(Zea mays)mitochondrion (الشكل 1). cRT-PCR يسمح رسم الخرائط في وقت واحد من 5 ‘و 3’ الأطراف من جزيء RNA، وعادة ما يتم تكييفها لخريطة termini نسخة في النباتات12،14،15. يمكن أن يزيل الحمض النووي الريبي 5 ‘polyphosphatase اثنين من الفوسفات من تيرميني ثلاثي الفوسفات 5 ‘، مما يجعل النصوص الأولية المتاحة للربط الذاتي من قبل الحمض النووي الريبي ligase. وأظهرت الدراسات السابقة أن ناضجة 26S rRNA في الذرة قد عالجت 5 ‘، وكان غير حساس لRNA 5 ‘polyphosphatase1،16. لتقليل تأثير ثلاثي الفوسفات غير المستقر في الترسيني الأولي 5’، يتم تطبيع 5 ‘متعدد الفوسفاتات المعالجة وغير المعالجة RNAs من قبل rRNA 26S ناضجة، ثم يتم تمييز النصوص الأولية والمجهزة عن طريق مقارنة cRT-PCR المنتجات التي تم الحصول عليها من عينات RNA اثنين. ويتم التحقق من نتائج رسم الخرائط والتمييز بين اللجنة من خلال اللطخة الشمالية وRT-qPCR، على التوالي. وأخيرا، يتم استخدام التمهيديات البديلة لتضخيم تلك النصوص التي تم الكشف عنها في وصمة عار الشمالية ولكن ليس عن طريق cRT-PCR. باستخدام هذه الاستراتيجية المستندة إلى CRT-PCR، تم تمييز معظم النصوص ثابتة الحالة في ميتوشوندريون الذرة ورسم خرائط1.

Protocol

1. التمهيدي التصميم 2. تصميم التمهيديات الجينات محددة للنسخ العكسي (RT) باستخدام PCR التمهيدي تصميم البرمجيات (جدولالمواد)على أساس القواعد العامة للتصميم التمهيدي17.ملاحظة: التمهيديات RT هي محددة للغاية للنصوص المستهدفة، وأنها ترتكز عموما على الجزء 5 ‘من ?…

Representative Results

تقدير كفاءة تعميم الحمض النووي الميتوكوندريا في دراسة سابقة، تم استخدام كل من RNAs الكلي والميتوكوندريا لرسم خرائط cRT-PCR من الميتوكوندريا نسخة تيرميني في أرابيدوبسي (أرابيدوبيس ثاليانا)،وقدم نوعين من RNAs نتائج رسم الخرائ…

Discussion

في دراسة سابقة، تم استخدام مجموع وRNS الميتوكوندريا من ثقافة تعليق الخلايا من Arabidopsis لرسم خريطة الميتوكوندريا نسخة تيرميني من قبل cRT-PCR، وتم الحصول على نتائج مماثلة12. ومع ذلك، تم استخدام الحمض النووي الميتوكوندريا المخصب فقط لرسم خريطة الميتوكوندريا نسخة تيرميني في العدي?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 31600250، Y.Z.)، ومشاريع العلم والتكنولوجيا في مدينة قوانغتشو (المنحة رقم 201804020015، H.N.)، ونظام البحوث الزراعية الصينية (رقم المنحة. CARS-04-PS09, H.N.).

Materials

Acetic acid Aladdin, China A112880 To prepare 1x TAE buffer
Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific, USA 4359659 Thermal cycler for PCR amplification
Ascorbic acid Sigma-aldrich, USA V900134 For preparation of extraction buffer
Biowest Agarose Biowest, Spain 9012-36-6 To resolve PCR products and RNAs
Bovine serum albumin Sigma-aldrich, USA A1933 For preparation of extraction buffer
Bromophenol blue Sigma-aldrich, USA B8026 For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot
DEPC Sigma-aldrich, USA V900882 Deactivation of RNase
DIG Northern starter kit Roche, USA 12039672910 For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection.
EDTA Sigma-aldrich, USA V900106 For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer
EGTA Sigma-aldrich, USA E3889 For preparation of wash buffer
Gel documentation system Bio-Rad, USA Gel Doc XR+ To image the agarose gel
Glycerol Sigma-aldrich, USA G5516 For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis
GoldView II (5000x) Solarbio,. China G8142 DNA staining
Hybond-N+, Nylon membrane Amersham Biosciences, USA RPN119 For Northern blot
Image Lab Bio-Rad, USA Image Lab 3.0 Image gel, and compare the abundance of PCR products.
KH2PO4 Sigma-aldrich, USA V900041 For preparation of extraction buffer
KOH Aladdin, China P112284 For preparation of extraction buffer
L-cysteine Sigma-aldrich, USA V900399 For preparation of extraction buffer
Millex Millipore, USA SLHP033RB To sterile extraction and wash buffers by filtration
Miracloth Calbiochem, USA 475855-1R To filter the ground kernel tissues
MOPS Sigma-aldrich, USA V900306 For preparation of running buffer for Northern blot
NanoDrop Thermo Fisher Scientific, USA 2000C For RNA concentration and purity assay
NaOH Sigma-aldrich, USA V900797 For preparation of wash buffer
pEASY-Blunt simple cloning vector TransGen Biotech, China CB111 Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site.
Phanta max super-fidelity DNA polymerase Vazyme, China P505 DNA polymerase for PCR amplification
Polyvinylpyrrolidone 40 Sigma-aldrich, USA V900008 For preparation of extraction buffer
Primer Premier 6.24 PREMIER Biosoft, USA Primer Premier 6.24 To design primers for reverse transcription and PCR amplification
PrimeScript II reverse transcriptase Takara, Japan 2690 To synthesize the first strand cDNA
PureLink RNA Mini kit Thermo Fisher Scientific, USA 12183025 For RNA purificaion
RNA 5' polyphosphatase Epicentre, USA RP8092H To convert 5' triphosphate to monophosphate
RNase inhibitor New England Biolabs, UK M0314 A component of RNA self-ligation and 5' polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase.
Sodium acetate Sigma-aldrich, USA V900212 For preparation of running buffer for Northern blot
Sodium chloride Sigma-aldrich, USA V900058 To prepare 20x SSC
SsoFas evaGreen supermixes Bio-Rad, USA 1725202 For RT-qPCR
T4 RNA Ligase 1 New England Biolabs, UK M0437 For RNA circularization
Tetrasodium pyrophosphate Sigma-aldrich, USA 221368 For preparation of extraction buffer
TIANgel midi purification kit Tiangen Biotech, China DP209 To purify DNA fragments from agarose gel
Tris Aladdin, China T110601 To prepare 1x TAE buffer
TRIzol reagent Invitrogen, USA 15596026 To extract mitochondiral RNA.
Universal DNA purification kit Tiangen Biotech, China DP214 To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction
Xylene cyanol FF Sigma-aldrich, USA X4126 For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis

References

  1. Zhang, Y., et al. Major contribution of transcription initiation to 5'-end formation of mitochondrial steady-state transcripts in maize. RNA Biology. 16 (1), 104-117 (2019).
  2. Choi, B. Y., Acero, M. M., Bonen, L. Mapping of wheat mitochondrial mRNA termini and comparison with breakpoints in DNA homology among plants. Plant Molecular Biology. 80 (4-5), 539-552 (2012).
  3. Calixte, S., Bonen, L. Developmentally-specific transcripts from the ccmFN-rps1 locus in wheat mitochondria. Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 419-426 (2008).
  4. Kuhn, K., Weihe, A., Borner, T. Multiple promoters are a common feature of mitochondrial genes in Arabidopsis. Nucleic Acids Research. 33 (1), 337-346 (2005).
  5. Jonietz, C., Forner, J., Holzle, A., Thuss, S., Binder, S. RNA PROCESSING FACTOR2 is required for 5′ end processing of nad9 and cox3 mRNAs in mitochondria of Arabidopsis thaliana. ThePlant Cell. 22 (2), 443-453 (2010).
  6. Stoll, B., Stoll, K., Steinhilber, J., Jonietz, C., Binder, S. Mitochondrial transcript length polymorphisms are a widespread phenomenon in Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 81 (3), 221-233 (2013).
  7. Mulligan, R. M., Lau, G. T., Walbot, V. Numerous transcription initiation sites exist for the maize mitochondrial genes for subunit 9 of the ATP synthase and subunit 3 of cytochrome oxidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (21), 7998-8002 (1988).
  8. Lupold, D. S., Caoile, A. G., Stern, D. B. The maize mitochondrial cox2 gene has five promoters in two genomic regions, including a complex promoter consisting of seven overlapping units. Journal of Biological Chemistry. 274 (6), 3897-3903 (1999).
  9. Yan, B., Pring, D. R. Transcriptional initiation sites in sorghum mitochondrial DNA indicate conserved and variable features. Current Genetics. 32 (4), 287-295 (1997).
  10. Rapp, W. D., Lupold, D. S., Mack, S., Stern, D. B. Architecture of the maize mitochondrial atp1 promoter as determined by linker-scanning and point mutagenesis. Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7232-7238 (1993).
  11. Rapp, W. D., Stern, D. B. A conserved 11 nucleotide sequence contains an essential promoter element of the maize mitochondrial atp1 gene. The EMBO Journal. 11 (3), 1065-1073 (1992).
  12. Forner, J., Weber, B., Thuss, S., Wildum, S., Binder, S. Mapping of mitochondrial mRNA termini in Arabidopsis thaliana: t-elements contribute to 5′ and 3′ end formation. Nucleic Acids Research. 35 (11), 3676-3692 (2007).
  13. Binder, S., Stoll, K., Stoll, B. Maturation of 5′ ends of plant mitochondrial RNAs. Physiologia Plantarum. 157 (3), 280-288 (2016).
  14. Hang, R. L., Liu, C. Y., Ahmad, A., Zhang, Y., Lu, F. L., Cao, X. F. Arabidopsis protein arginine methyltransferase 3 is required for ribosome biogenesis by affecting precursor ribosomal RNA processing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16190-16195 (2014).
  15. Wang, H. Q., et al. Maize Urb2 protein is required for kernel development and vegetative growth by affecting pre-ribosomal RNA processing. New Phytologist. 218 (3), 1233-1246 (2018).
  16. Maloney, A. P., et al. Identification in maize mitochondrial 26S rRNA of a short 5′-end sequence possibly involved in transcription initiation and processing. Current Genetics. 15 (3), 207-212 (1989).
  17. Green, R. M., Sambrook, J. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2012).
  18. Canino, G., et al. Arabidopsis encodes four tRNase Z enzymes. Plant Physiology. 150 (3), 1494-1502 (2009).
  19. Gobert, A., et al. A single Arabidopsis organellar protein has RNase P activity. Nature Structural, Molecular Biology. 17, 740-744 (2010).
  20. Gutmann, B., Gobert, A., Giege, P. PRORP proteins support RNase P activity in both organelles and the nucleus in Arabidopsis. Genes & Development. 26 (10), 1022-1027 (2012).
  21. Stern, D. B., Goldschmidt-Clermont, M., Hanson, M. R. Chloroplast RNA metabolism. Annual Review of Plant Biology. 61, 125-155 (2010).

Play Video

Cite This Article
Zhang, Y., Liao, X., Luo, P., Peng, K., Ye, W., Lian, T., Ma, Q., Nian, H. Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy. J. Vis. Exp. (149), e60019, doi:10.3791/60019 (2019).

View Video