Perturbando a biomecânica endotelial via connexin 43 disrupção estrutural
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo baseado em mecânica para interromper a junção de Gap conexina 43 e medir o impacto subsequente que isso tem sobre a biomecânica endotelial através da observação de tracções e tensões intercelulares.
Abstract
As células endoteliais foram estabelecidas para gerar tensões e tracções intercelulares, mas as junções de Gap de papel desempenham no estresse intercelular endotelial e a geração de tração é atualmente desconhecida. Conseqüentemente, nós apresentamos aqui um protocolo mecânica-baseado para sondar a influência do conexina 43 da junção da abertura (Cx43) tem na biomecânica endothelial expondo monocamadas endothelial confluente a um inibidor conhecido do Cx43 2, a 5-dihydroxychalcone (chalcone) e medir o impacto que este inibidor tem sobre tracções e tensões intercelulares. Nós apresentamos resultados representativos, que mostram uma diminuição em ambos os trações e tensões intercelular uma dosagem elevada do Chalcona (2 μg/ml) quando comparado ao controle. Este protocolo pode ser aplicado a não apenas Cx43, mas também outras junções de Gap, assumindo que o inibidor apropriado é usado. Acreditamos que este protocolo será útil nos campos da pesquisa cardiovascular e mecanobiologia.
Introduction
O campo que se refere ao estudo dos efeitos das forças físicas e das propriedades mecânicas na fisiologia e patologia celular e tecidual é conhecido como mecanobiologia1. Algumas técnicas úteis que têm sido utilizadas na mecanobiologia são A microscopia de estresse monocamada e A microscopia de força de tração. A microscopia da força da tração permite a computação dos trações gerados na relação da pilha-carcaça, quando a microscopia de esforço do monocamada permitir a computação de tensões intercelular geradas entre pilhas adjacentes dentro de um monocamada2 ,3,4,5,6. Os resultados obtidos a partir de métodos anteriores sugeriram que as tensões mecânicas derivadas de células desempenham um papel crucial na determinação do destino de uma série de processos celulares3,4,5. Por exemplo, após a exposição a uma força mecânica externa, um grupo de células migrando como um coletivo pode alterar sua morfologia e polarizar sua forma de alinhar e migrar ao longo da direção da força aplicada, em parte, gerando tracções7, a 8. As tracções fornecem uma métrica que pode ser usada para avaliar a contratilidade celular e são calculadas usando a microscopia de força de tração (TFM). A microscopia de força de tração (TFM) começa com a determinação de deformações de substrato induzidas por células seguidas pelo cálculo do campo de tração usando uma abordagem computacional matematicamente rigorosa e baseada em mecânica. Uma vez que a capacidade de calcular trações tem sido em torno de algum tempo, os pesquisadores têm utilizado TFM para revelar as tracções de impacto têm em uma série de processos, incluindo o câncer9, cicatrização de feridas10 e avaliação de engenharia cardíaca tecido11.
A implementação de TFM e MSM juntos pode ser dividida em três etapas essenciais que devem ser executadas na seguinte ordem: primeiro, as deformações de hidrogel produzidas pelas células são determinadas; segundo, os trações são recuperados das deformações do hidrogel; e em terceiro lugar, uma aproximação do elemento finito é usada para computar tensões intercelular normais e da tesoura dentro da monocamada inteira. Para computar deslocamentos do gel, as imagens do grânulo da fluorescência com pilhas foram comparadas com a imagem do grânulo da referência (sem pilhas) usando uma rotina costume-escrita da Velocimetria da imagem da partícula (PIV). O tamanho da janela de correlação cruzada e a sobreposição para a análise de PIV foram escolhidos para 32 x 32 pixels e 0,5, respectivamente. Neste momento, os deslocamentos de pixel foram convertidos em mícrons multiplicando-se com um fator de conversão de pixel a mícron (para nosso microscópio, esse fator de conversão é 0,65) para obter deslocamentos no plano. Erros associados a ignorar deslocamentos fora do plano são negligenciáveis12,13. Após a computação de deslocamentos do gel, há dois tipos de medidas da tração que podem ser utilizadas, trações restringidos e trações unrestringidos8,14. As tracções não restritas fornecem o campo de tração para todo o campo de visão (incluindo regiões com e sem células), enquanto as tracções restritas fornecem o campo de tração somente para regiões que incluem células14. Em seguida, as tensões intercelulares são calculadas usando a microscopia de estresse monocamada (MSM), que é uma extensão da microscopia de força de tração. A implementação de MSM baseia-se na suposição de que as tracções locais exercidas por uma monocamada de células na interface de substrato celular devem ser equilibradas por forças mecânicas transmitidas entre células na interface célula-célula, conforme exigido pelas leis de Newton7 ,12,13. Uma suposição chave aqui é que o monocamada da pilha pode ser tratado como uma folha elástica fina porque a distribuição da tração no monocamada é sabida e o contrapeso da força não depende das propriedades do material da pilha. Outra suposição fundamental é que as forças de tração são equilibradas por tensões intercelulares locais dentro do campo óptico de visão (dentro da monocamada) e a influência desse equilíbrio de força é mínima na região distal (fora da monocamada)13. Portanto, as condições de contorno definidas por tensões intercelulares, deslocamentos ou uma combinação de ambos no limite de monocamada são cruciais para executar MSM13. Tendo em conta as informações acima, utilizamos MSM para realizar uma análise de elementos finitos (FEM) para recuperar a tensão principal máxima (σmáx) e tensão principal mínima (σmin) girando o plano de tensão em cada ponto dentro do monocamada. Estas tensões principais são usadas subseqüentemente para computar a 2D tensão intercelular normal média [(σMax + σmin)/2] e o esforço intercelular do cisalhamento máximo 2D [(σMax -σmin)/2] dentro da monocamada inteira 12,13. Este procedimento é descrito com mais detalhes por tambe et al.12,13
A microscopia de estresse monocamada (MSM) permite o cálculo das tensões intercelulares celulares geradas dentro de uma monocamada6,7,8,12,13. Essas tensões intercelulares têm sido sugeridas para serem importantes para o crescimento e reparo tecidual, cicatrização de feridas e metástase oncológica12,15,16,17. Além disso, as tensões intercelulares têm sido sugeridas para também serem importantes namigração de célulasendoteliais e na função da barreira endotelial17,18. Quando as junções da pilha-pilha tais como junções apertadas e junções dos aderens tiverem sido sugeridas para jogar um papel crítico na geração e na transmissão intercelular endoteliais do esforço, o papel de junções da abertura permanece indescritível. As junções da abertura conectam fisicamente pilhas adjacentes e fornecem um caminho para a corrente elétrica e as moléculas (< 1 kDa) para passar entre as pilhas vizinhas19,20,21. Embora as células endoteliais expressem Cx37, Cx40 e Cx43 junções Gap19,22, Cx43 é indiscutivelmente o mais importante em termos de progressão da doença23. Evidências de Cx43’s importância podem ser encontradas no fato de que o apagamento genético de Cx43 em camundongos resulta em hipotensão24 e tem efeitos adversos na angiogênese25. Além disso, Cx43 tem sido documentado para ser importante para a migração e proliferação celular e na progressão da aterosclerose18,22,23,24,25 .
Neste protocolo, utilizou-se TFM e HSH para investigar se a tração e a geração de estresse intercelular dentro do confluente, monocamada endotelial seriam impactadas pelo rompimento da junção de Gap endotelial Cx43. Nós interrompemos Cx43 com 2,5-dihydroxychalcone (chalcone), uma molécula documentada para inibir Cx43 expressão26. Chalcona foi usado para interromper Cx43 em vez de siRNA como o Chalcona foi relatado previamente por Lee et al. para interromper Cx43 expressão26. Além disso, estávamos particularmente interessados na influência do chalcone no endotélio, pois também foi relatado como um composto anti-inflamatório e antiplaquetário que pode potencialmente ser usado para a prevenção e tratamento de vários patologias26. Os tratamentos com chalcone foram realizados uma hora após o início do experimento, monocamadas tratados com chalcone foram fotografados por um total de seis horas, e o processamento de imagens foi realizado com um código MATLAB personalizado para determinar tracções e, subsequentemente, intercelular Salienta. Nossos resultados mostraram uma diminuição total em trações e em tensões intercelular, sugerindo que Cx43 Jogue um papel chave na biomecânica endothelial.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nosso grupo, assim como outros, tem sido com sucesso usando TFM e msm para sondar a influência de junções Cell-Cell em vários processos celulares patológicos e fisiológicos in vitro7,15,18,27 . Por exemplo, Hardin et al. apresentaram um estudo muito perspicaz que sugere a transmissão do estresse intercelular orienta a formação de Gap paracelular nas células endoteliais<sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelos fundos de start-up da Universidade de Florida Central e pelo Instituto Nacional de coração, pulmão e sangue do Instituto Nacional de saúde o prêmio K25HL132098.
Materials
| 18 mm coverslip | ThermoFisher | 18CIR-1 | Essential to flatten polyacrylamide gels |
| 2% bis-acrylamide | BIO-RAD | 1610143 | Component of polyacrylamide gel |
| 2′,5′-Dihydroxychalcone | SIGMA | IDF00046 | To disrupt Cx43 structure |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | SIGMA | 2530-85-0 | Stock solution to make bind silane mixture with acetic acid and ultra-pure water |
| 40% Acrylamide | BIO-RAD | 1610140 | Component of polyacrylamide gel |
| Acetic acid | Fisher-Sceintific | 64-19-7 | Essential to make bind saline solution |
| Alexa Fluro 488 goat anti-mouse IgG; | ThermoFisher | Catalog # A-11001 | Secondary antibody |
| Ammonium persulfate | BIO-RAD | 1610700 | Polyacrylamide gel polymerizing agent |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | SIGMA | 9048-46-8 | To make blocking solution |
| Bovine Type I Atelo-Collagen Solution, 3 mg/mL, 100 mL | Advance Biomatrix | 5005-100ML | Use as a extracellular matrix |
| Corning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x) | Fisher-Sceintific | 21040CV | Buffer Saline needed for cell culture |
| Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagents | Fisher-Sceintific | 67-68-5 | To dissolve chalcone and make stock solution |
| Fluoromount-G with DAPI | ThermoFisher | 00-4959-52 | Mounting medium for immunostaing used to stain for DAPI |
| Fluroscent microsphere Carboxylate-modified beads | ThermoFisher | F8812 | 0.5 micron carboxylate-modified beads (red), 2% solids |
| HEPES buffer solution 1 M | SIGMA | 7365-45-9 | Essential to |
| LVES | ThermoFisher | A1460801 | Essential HUEVC media 200 supplement |
| Medium 200 | ThermoFisher | M200500 | Essential media for HUVEC cell culture |
| Mouse monoclonal Cx43 antibody (CX – 1B1) | ThermoFisher | Catalog #13-8300 | Primary antibody for Cx43 |
| Petri dish (35 mm dia) | CellVis | D35-20-1.5H | 35 mm petri dish with a 20 mm center well |
| Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg | Proteochem | 102568-43-4 | Essential to functionalize polyacrylamide gel surface |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | DOW corning | 2646340 | Silicon elastomer with curing agent to make PDMS |
| TEMED | BIO-RAD | 1610801 | Polyacrylamide gel polymerizing agent |
| Triton-X 100 | SIGMA | 9002-93-1 | To permeabilize cells |
| Trypsin -EDTA | ThermoFisher | 25300054 | Used to detach cells |
References
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