Summary

Método de electroporación para la entrega in Vivo de ADN plásmido en el telencéfalo adulto de pez cebra

Published: September 13, 2019
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Summary

Aquí se presenta un método de electroporación para la entrega de ADN plásmido y el etiquetado de células ependimarinas en el telencéfalo adulto de pez cebra. Este protocolo es un método rápido y eficiente para visualizar y rastrear células ependymoglial individuales y abre nuevas posibilidades para aplicar la electroporación a una amplia gama de manipulaciones genéticas.

Abstract

La electroporación es un método de transfección en el que se aplica un campo eléctrico a las células para crear poros temporales en una membrana celular y aumentar su permeabilidad, permitiendo así introducir diferentes moléculas en la célula. En este artículo, la electroporación se utiliza para introducir plásmidos a las células ependigliales, que recubren la zona ventricular del telencéfalo adulto del pez cebra. Una fracción de estas células muestra propiedades de células madre y genera nuevas neuronas en el cerebro del pez cebra; por lo tanto, estudiar su comportamiento es esencial para determinar sus funciones en la neurogénesis y la regeneración. La introducción de plásmidos a través de la electroporación permite el etiquetado y seguimiento a largo plazo de una sola célula ependymoglial. Además, los plásmidos como Cre recombinase o Cas9 pueden ser entregados a células ependymoglial únicas, lo que permite la recombinación genética o la edición genética y proporciona una oportunidad única para evaluar la función génica autónoma de la célula en un control natural Ambiente. Por último, este protocolo de electroporación detallado paso a paso se utiliza para obtener una introducción exitosa de plásmidos en un gran número de células ependimarinas individuales.

Introduction

Zebrafish son excelentes modelos animales para examinar la regeneración cerebral después de una lesión en la herida de puñalada. En comparación con los mamíferos, en la escala evolutiva, las especies menos evolucionadas como el pez cebra generalmente muestran tasas más altas de neurogénesis constitutiva y áreas más amplias de residencia de células madre neurales adultas, lo que conduce a la generación constante de nuevas neuronas a lo largo de la mayoría de las áreas cerebrales en la vida adulta. Esta característica parece correlacionarse con una capacidad regenerativa significativamente mayor del pez cebra en comparación con los mamíferos1, ya que los peces cebra tienen un potencial notable para generar eficientemente nuevas neuronas en la mayoría de los modelos de lesiones cerebrales estudiados2, 3,4,5,6,7,8. Aquí se estudia el telencéfalo de pez cebra, ya que es un área cerebral con neurogénesis prominente en la edad adulta. Estas zonas de neurogénesis adulta son homoólogas a zonas neurogénicas en el cerebro adulto demamíferos9,10,11.

Abundantes áreas neurogénicas en el telencéfalo de pez cebra están presentes debido a la existencia de glia radial como células o células de ependymoglia. Las células ependymoglial actúan como células madre neurales adultas residentes y son responsables de la generación de nuevas neuronas en el cerebro intacto y regenerador3,5. Los experimentos de rastreo de linaje han demostrado que la ependymoglia ventricular reacciona a la lesión, luego proliferan y generan nuevos neuroblastos que migran al sitio de la lesión5. Debido a la naturaleza evertida del telencéfalo de pez cebra, las células epentimoglial eslacionan la superficie ventricular y construyen la pared ventricular ventral. La pared ventricular dorsal está formada por una capa de células ependitas dorsales(Figura 1A). Es importante destacar que la epentioglia del pez cebra encarna las características tanto de la glia radial de mamíferos como de las células epentimales. Los procesos radiales largos son una característica típica de las células glia radiales, mientras que las extensiones celulares y las uniones estrechas (así como sus posiciones ventriculares) son características típicas de las células epentimales12,13,14. Por lo tanto, estas células se conocen como células epenymoglial.

Para seguir el comportamiento in vivo de células ependymoglial individuales durante la regeneración, deben etiquetarse de forma fiable. Se han descrito previamente varios métodos de etiquetado de células in vivo para microscopía fluorescente, como reporteros endógenos o colorantes lipofílicos15. Estos métodos, a diferencia de la electroporación, pueden requerir períodos de tiempo más largos y a menudo no ofrecen la posibilidad de etiquetado de una sola célula o rastreo permanente a largo plazo. La electroporación, sin embargo (además del etiquetado de una sola célula), ofrece la posibilidad de introducir nuevo ADN en la célula huésped. Además, en comparación con otros métodos de transferencia de ADN a las células, se ha demostrado que la electroporación es uno de los métodos más eficientes16,17,18,19.

Aquí se presenta un protocolo de electroporación que se ha refinado con el fin de etiquetar células ependymoglial únicas en el telencéfalo adulto de pez cebra. Este protocolo permite el etiquetado de células epentimogliales individuales con el fin de seguirlas a largo plazo20 o manipular vías específicas de manera autónoma celular21,22.

Protocol

Todos los animales utilizados en este protocolo se mantuvieron en condiciones estándar de cría, y los experimentos se han realizado de acuerdo con las directrices y reglamentos de manipulación de la UE y el Gobierno de Alta Baviera (AZ 55.2-1-54-2532-0916). 1. Preparación de la mezcla de plásmido para la electroporación Diluir el plásmido de interés en agua estéril y añadir solución de tinción verde rápida [1 mg/ml]. Asegúrese de que la concentración final del plásmid…

Representative Results

El método de electroporación descrito permite la entrega de ADN plásmido en células ependymoglial, que se encuentran superficialmente en el telencéfalo de pez cebra y justo debajo de la capa de células epentimales dorsales(Figura 1A). Si el resultado de la electroporación es positivo, se pueden observar células ependymoglial (células rojas en la Figura 2A,B)entre otras cél…

Discussion

Este protocolo de electroporación es un método in vivo fiable de etiquetado de células epentimoglial individuales. El protocolo puede necesitar una adaptación adicional para etiquetar otros tipos de células como neuronas u oligodendrocitos. Para lograr un etiquetado exitoso, se pueden utilizar plásmidos que contengan diferentes promotores. Promotor de actina de pollo-beta, eF1alpha, CMV y promotor de ubiquitina se han utilizado previamente para impulsar la expresión de diferentes transgenes en ependymoglia y su pr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Un agradecimiento especial a James Copti por editar el manuscrito. También agradecemos la financiación a JN de la Fundación Alemana de Investigación (DFG) por el SFB 870 y SPP “Análisis Integrativo de Olfacción” y SPP 1738 “Funciones emergentes de ARN no codificantes en el desarrollo del sistema nervioso, plasticidad y enfermedad”, SPP1757 ” Heterogeneidad glial”, y Estrategia de Excelencia en el marco del Clúster de Neurología de Sistemas de Múnich (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198).

Materials

Reagent/Material
Fast Green Sigma-Aldrich F7258-25G For coloring plasmid solution
MS222 Sigma-Aldrich A5040-25G MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light
Ultrasound gel SignaGel, Parker laboratories INC. 15-60 Electrode Gel
Equipment
Air pump TetraTec APS 50, 10l-60l Can be bought in the pet shops
BTX Tweezertrodes Electrodes Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus 45-0486 1mm diameter
Electroporation device BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus 45-0662
Injection device FemtoJet 4i, Eppendorf 5252000013
Standard Wall Borosillicate Glass Capillary Warner Instruments 64-0766 Model No: G100-4
Microloader tips Eppendorf 5242956003
Micro-knife Fine Science Tools 10056-12
Joystick micromanipulator Narishige Japan MN – 151
Needle holder FemtoJet 4i, Eppendorf 5252000013 Needle holder comes together with the injection device
Needle pulling device Narishige Japan Model No: PC-10 The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100
Petri dishes Greiner Bio-One International 633161

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Cite This Article
Durovic, T., Ninkovic, J. Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon. J. Vis. Exp. (151), e60066, doi:10.3791/60066 (2019).

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