Modelo Quirúrgico Murino de Aneurisma aórtico torácico descendente fortuito tópico
Summary
Describimos un protocolo quirúrgico para inducir consistentemente aneurismas de la aorta torácica descendentes robustos en ratones. El procedimiento consiste en la toracotomía izquierda, la exposición a la aorta torácica y la colocación de una esponja empapada en elastasa pancreática porcina en la pared aórtica.
Abstract
Según el Centro para el Control de Enfermedades, los aneurismas aórticos (AA) fueron considerados una de las principales causas de muerte en todas las razas y ambos sexos de 1999 a 2016. Se forma un aneurisma como resultado del debilitamiento progresivo y la dilatación eventual de la aorta, que puede romperse o desgarrarse una vez que alcanza un diámetro crítico. Los aneurismas de la aorta descendente en el pecho, llamados aneurismas de la aorta torácica descendente (dTAA), conforman una gran proporción de casos de aneurisma en los Estados Unidos. La ruptura dTAA no contenida es casi universalmente letal, y la reparación electiva tiene una alta tasa de morbilidad y mortalidad. El propósito de nuestro modelo es estudiar dTAA específicamente, dilucidar la fisiopatología de dTAA y buscar dianas moleculares para detener el crecimiento o reducir el tamaño de dTAA. Al tener un modelo murino para estudiar la patología torácica con precisión, se pueden desarrollar terapias dirigidas para probar específicamente la dTAA. El método se basa en la colocación de la elastasa pancreática porcina (EPP) directamente en la pared aórtica murinosexterna después de la exposición quirúrgica. Esto crea una reacción destructiva e inflamatoria, que debilita la pared aórtica y permite la formación de aneurisma durante semanas o meses. Aunque los modelos murinos poseen limitaciones, nuestro modelo dTAA produce aneurismas robustos de tamaño predecible. Además, este modelo se puede utilizar para probar objetivos genéticos y farmacéuticos que pueden detener el crecimiento de dTAA o prevenir la ruptura. En pacientes humanos, intervenciones como estas podrían ayudar a evitar la ruptura del aneurisma y la difícil intervención quirúrgica.
Introduction
El propósito de este método es estudiar el desarrollo, la fisiopatología y los cambios estructurales en la aorta torácica descendente murina durante la formación del aneurisma aórtico. Nuestro modelo ofrece un método reproducible y consistente para inducir aneurismas de la aorta torácica (dTAA) en ratones permitiendo así la prueba de diversos inhibidores genéticos y farmacológicos. Este trabajo puede ayudar a identificar fármacos y terapias génicas que podrían traducirse en una estrategia de tratamiento viable para los seres humanos con enfermedad de dTAA.
los dTAa se forman cuando la pared de la aorta torácica se debilita y se dilata con el tiempo hasta alcanzar un diámetro crítico al rasgarse o romperse. Clínicamente, dTAA puede progresar en silencio, aumentando de tamaño hasta que la estructura de la pared aórtica está tan distorsionada que finalmente falla, con consecuencias catastróficas. En cuanto a todo, los síntomas generalmente se desarrollan sólo cuando el aneurisma ha alcanzado un tamaño peligroso (100-150% dilatación) y está en alto riesgo de disección o ruptura1,2. la ruptura dTAA escasi universalmente letal 3, y la reparación quirúrgica electiva conlleva una morbilidad significativa4,5. Además, la mayoría de los pacientes llevan el diagnóstico de un aneurisma aórtico durante aproximadamente 5 años antes de la reparación quirúrgica6,7. Esta ventana representa un momento oportuno para intervenir no quirúrgicamente. Por lo tanto, se necesitan terapias médicas para tratar o la progresión lenta de la dTAA y representarían un avance significativo en el campo de la investigación del aneurisma. Actualmente no hay tratamientos médicos para dTAA disponibles, principalmente debido a una comprensión incompleta de la patogénesis dTAA.
En los últimos 20 años, se han desarrollado varios modelos animales dTAA, pero cada uno de estos modelos fueron distintos de los nuestros y no produjeron aneurismas robustos. Un modelo dTAA murino más similar al nuestro fue desarrollado por Ikonomidis et al.8, que incluye la aplicación directa de CaCl2 a la adventitia de la aorta. Aunque nuestro modelo fue adaptado de muchas de las técnicas establecidas por Ikonomidis, nuestro modelo es único en tres maneras separadas. En primer lugar, en nuestro modelo la aorta se expone a la elastasa tópica durante 3-5 minutos, en comparación con 15 minutos de exposición a CaCl 2. En segundo lugar, la dilatación aórtica ocurre en 2 semanas, en comparación con 16 semanas en el modelo CaCl 2. Por último, nuestro modelo produce consistentemente aneurismas de aproximadamente 100% de dilatación, en comparación con las dilataciones aórticas de 20-30% producidas por la aplicación CaCl2 (que no pueden considerarse verdaderamente aneurismas como se definen como un aumento de la aórtica diámetro >50%). Existen otros modelos murinos no quirúrgicos de formación de aneurisma, como el ratón noqueador Apo E, que forman aneurismas robustos con infusión de angiotensina II. Sin embargo, estos ratones desarrollan aneurismas de la aorta torácica suprarrenal o ascendenteen lugar de aneurismas específicamente en la aorta torácica descendente 9,10.
La razón de este protocolo es tener una manera simple, económica y adecuada para estudiar dTAA en un modelo murino. El modelo de ratón proporciona una oportunidad única para utilizar muchos knockouts genéticos y celulares específicos que se han encontrado para ser impactantes en otras enfermedades vasculares. El uso de nuestro modelo TAA específico ha sido bien recibido y los experimentos que lo utilizan se han publicado en revistas de alto impacto11,12. Hasta este punto, el modelo se ha utilizado para investigar posibles tratamientos genéticos y farmacológicos que tuvieron un efecto significativo en los modelos de aneurisma de la aorta abdominal (AAA); sin embargo, a medida que nuestro laboratorio ha ampliado el uso del modelo dTAA, estamos encontrando objetivos únicos para la formación de dTAA que podrían ser utilizados como terapias dirigidas en seres humanos.
Este modelo es más adecuado para laboratorios que tienen capacidades microquirúrgicas murinas. Aunque es técnicamente difícil, puede ser ejecutado consistentemente incluso por investigadores sin experiencia quirúrgica previa. Para un investigador sin experiencia quirúrgica murina, el modelo se puede dominar en aproximadamente 20 sesiones operativas (o aproximadamente 50 ratones). Para el investigador con experiencia quirúrgica previa, el modelo se puede dominar en 5 sesiones operativas (aproximadamente 20 ratones). Creemos que con un vídeo de alta calidad, el tiempo de dominio se puede reducir aún más. Después de la competencia, el procedimiento se puede completar en 35 minutos para la cirugía, y 20 minutos para la cosecha terminal. Los cirujanos de nuestro laboratorio pueden completar entre 10 y 12 cirugías completas por día, con una tasa de mortalidad operativa del 5-10%. La causa más común de mortalidad es la lesión pulmonar al entrar en el pecho, toxicidad anestésica o desgarro de la aorta durante la disección. Además de la investigación dTAA, este modelo también sirve como una guía para un acceso seguro y fácil a la aorta torácica y al hilum pulmonar para los investigadores que estudian otras intervenciones en el pecho.
Protocol
Representative Results
Discussion
La aorta torácica y abdominal son celular y embrionariamente distintas, lo que es relevante para la enfermedad aneurisma14,15,16. Por lo tanto, se necesita un modelo animal específico para estudiar TAA. Aunque otros modelos de dTAA murinos se han publicado8, el nuestro es el único modelo para crear dilatación aórtica torácica descendente que puede considerarse verdaderamente aneurisma (más del 50% …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de la Subvención de Desarrollo Científico de la AHA 14SDG18730000 (M.S.), NIH K08 HL098560 (G.A.) y RO1 HL081629 (G.R.U.). Este proyecto fue apoyado por la Beca de Investigación de la Fundación de Cirugía Torácica para la Investigación y la Educación (TSFRE) (PI: G. Ailawadi). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones de la NHLBI o del TSFRE. Agradecemos a Anthony Herring y Cindy Dodson por su conocimiento y experiencia técnica.
Materials
| Angiocatheter (22G) | Used for ET Tube | ||
| Dumont Tweezers; Pattern #7 x2 | Roboz | RS-4982 | |
| Graefe Tissue Forceps | Roboz | RS-5158 | |
| Harms Forceps x2 | Roboz | RS-5097 | |
| Intracardiac Needle Holder; Extra Delicate; Carbide Jaws; 7" Length | Roboz | RS-7800 | |
| KL 1500 LED Light Source | Leica | 150-400 | |
| M205A Dissction Microscope | Leica | CH 94-35 | |
| Iris Scissors, 11cm, Tungsten Carbide | World Precision Instruments | 500216-G | |
| Metal Clip board | Use with the Mouse Retractor Set | ||
| Mouse Retractor Set | Kent | SURGI-5001 | Need 2 short and 1 tall fixators |
| Mouse Ventilator MiniVent Type 845, 115 V, Power Supply with US Connector | Harvard Apparatus | 73-0043 | MiniVent Ventilator for Mice (Model 845), Single Animal, Volume Controlled |
| Sigma Aldrich | Elastase from porcine pancreas | E0258-50MG | Can be purchased in various size bottles |
| Small Vessel Cauterizer Kit | Fine Science Tools | 18000-00 | Recommend using rechargable AA batteries |
| Spring Scissors, 10.5cm | World Precision Instruments | 14127 | |
| Steril Swabs (Sponges) | Sugi | 31603 | Can be cut to size |
| Surgi Suite Surgical Platform | Kent | Attach to clip board | |
| Tech IV Isoflurane Vap | Jorgensen Laboratories | J0561A | Anesthesia vaporizer |
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