Ozon Maruziyetinden Sonra Alveoler Makrofaj Eferositozun Vivo Değerlendirilmesi
Summary
Bu el yazması, hava kirletici bir kriter olan ozon maruziyetinin alveoler makrofaj efferositozisinin in vivo’yu bozup bozmadığını belirleyen bir protokolü açıklamaktadır. Bu protokol yaygın olarak kullanılan reaktifler ve teknikler kullanır ve alveoler makrofaj eferositoz üzerindeki etkilerini belirlemek için pulmoner yaralanma birden fazla modeladapte edilebilir.
Abstract
Ozon (O3),kronik akciğer hastalıklarının görülme sıklığını arttıran ve şiddetlendiren bir kriterdir. O3 maruziyetin pulmoner inflamasyonu tetiklemesi bilinmektedir, ancak maruz kalmanın inflamasyonun çözümü için önemli süreçleri nasıl değiştirdiği konusunda çok az şey bilinmektedir. Eferositoz, makrofajların apoptotik hücreleri fagositize ettiği bir çözüm sürecidir. Bu protokolün amacı O3-indüklenen akciğer hasarı ve inflamasyon aşağıdaki alveoler makrofaj eferositoz ölçmektir. Eferositozun ölçümü için çeşitli yöntemler tanımlanmıştır; ancak, çoğu ex vivo manipülasyonlar gerektirir. Burada ayrıntılı olarak açıklanan o3 pozlama dan sonra 24 saat in vivo alveolar makrofaj efferocytozis ölçmek için bir protokol, hangi makrofajlar ex vivo manipülasyon önler ve doğru pertürbations temsil etmek için kullanılabilecek basit bir teknik olarak hizmet vermektedir bu çözüm süreci. Protokol, genel anestezi altında yken tüm vücut O3 inhalasyonu ve ardından apoptotik hücrelerin orofatojiel aspirasyonu (jurkat T hücreleri) içeren teknik olarak yoğun olmayan ve nispeten ucuz bir yöntemdir. Alveoler makrofaj eferositoz bronkoalveoler (BAL) lavajından toplanan makrofajların ışık mikroskobu ile ölçülür. Eferositoz sonunda bir eferositik indeks hesaplanarak ölçülür. Topluca, ana hatlarıyla yöntemler in vivo akciğerde eferositik aktivite ölçmek de O3 veya diğer inhale hakaret olumsuz sağlık etkilerini analiz etmek için hizmet vermektedir.
Introduction
Akciğer sürekli hava partikülleri, virüsler, bakteriler ve akciğer iltihabı tetikleyen oksidan gazlar da dahil olmak üzere çevresel hakaretlere maruz kalmaktadır1,2,3. Bu hakaretler gaz değişimini tehlikeye atabilir ve geri dönüşü olmayan doku yaralanmasına neden olabilir4,5. Homeostazı’nda rürve insan akciğerlerinde bulunan bağışıklık hücrelerinin yaklaşık %95’ini oluşturan alveoler makrofajlar, çevresel hakaretlerden sonra pulmoner inflamasyonun kritik düzenleyicileridir1,2, 3,4,5. Alveoler makrofajlar fagositosiyon ve patojenleri ortadan kaldırarak konak savunma sırasında esastır. Son zamanlarda, alveoler makrofajlar doku homeostazı ve eferositoz yoluyla inflamasyon çözünürlüğü teşvik gösterilmiştir6,7. Eferositoz hangi makrofajlar yutmak ve apoptotik hücreleri ortadan kaldırmak bir fagositiksüreçtir 8,9,10. Eferositoz aynı zamanda aracıların (il-10, TGF-β, PGE2ve nitrik oksit) üretimine de yol açar ve bu da süreci daha da güçlendirerek inflamasyonun çözülmesiyle sonuçlanır9,10,11 ,12,16,18. Bu süreç sekonder nekroz önlenmesi ve doku homeostaz teşvik etmek için gereklidir12,13,14. Çeşitli çalışmalar astım, kronik obstrüktif akciğer hastalığı ve idiyopatik pulmoner fibrozis8,9,15dahil olmak üzere çeşitli kronik akciğer hastalıkları ile bozulmuş eferositoz bağlantılı var, 16,17.
O3, kronik akciğer hastalıklarının görülme sıklığını arttıran ve artıran bir kriterdir19,20,21. O3 pulmoner inflamasyon ve yaralanma neden olur ve bakteriyel patojenlerin alveoler makrofaj fagositoz bozan bilinmektedir22,23. Ancak, O3 alveoler makrofaj eferositoz bozar olup olmadığı bilinmemektedir. Alveoler makrofaj eferositozda O 3-indüklenen değişikliklerin araştırılması, maruziyetin kronik akciğer hastalığı insidansına ve alevlenmeye nasıl yol açabileceği konusunda potansiyel bir fikir verecektir. Aşağıda açıklanan akut O3 maruziyeti sonrası kadın farelerin akciğerlerinde alveoler makrofaj eferositoz değerlendirmek için basit bir yöntemdir.
Ana hatlarıyla kullanılan yöntem, pahalı floresan boyaların, geniş akış sitometri ölçümlerinin ve alveoler makrofajların ex vivo manipülasyonunun ortadan kaldırılmasıyla bu alanda yaygın olarak kullanılan diğer eferositoz protokollerine göre çeşitli avantajlar sağlar24 ,25. Ayrıca, bu protokol, makrofaj fonksiyonunu etkileyebilen akciğer mikroçevre bağlamında alveoler makrofaj eferositozunu ölçer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Efferocytosis hangi makrofajlar apoptotik hücreleri ve enkaz temizlemek yanı sıra birden fazla anti-inflamatuar mediatör 9 üretmek bir anti-inflamatuar süreçtir9,10,11,12,16 ,18. Eferositoz birden fazla model nasıl makrofaj inflamasyon çözünürlüğünde kritik bir hücre nasıl içgörü sağlamıştır<sup class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Sağlık Etkileri Enstitüsü Walter A. Rosenblith Ödülü ve NIEHS R01ES028829 (K. M. G için) tarafından finanse edilmektedir. Dr. Dianne Walters’a (Fizyoloji Bölümü, ECU) alveoler makrofajların temsili görüntülerini elde etmedeki yardımları için teşekkür ederiz.
Materials
| Annexin V-FITC Kit | Trevigen | 4830-250-K | The TACS Annexin V-FITC Kit allows rapid, specific, and quantitative identification of apoptosis in individual cells when using flow cytometry. |
| BCL2 Jurkat T Cells | ATCC | ATCC CRL-2899 | The BCL2 Jurkat cell line was derived by transfecting human Jurkat T cells with the pSFFV-neo mammalian expression vector containing the human BCL-2 ORF insert and a neomycin-resistant gene. Has been for models of measuring efferocytosis. |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermofisher | AMQAX1000 | It is a benchtop assay platform equipped with state-of-the-art optics, full autofocus, and image analysis software for rapid assessment of cells in suspension. Very easy to use. |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermofisher | A78300003 | Provides economical thin-layer preparations from any liquid matrix, especially hypocellular fluids such as bronchoalveolar lavage fluid. |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Thermofisher | 16140071 | Provides Nutrients to cultured cells for them to grow. It is standard for cell culture. |
| Kwik-Diff Reagent 2, Eosin | Thermofisher | 9990706 | Eosin staining that stains cytoplasm. |
| Kwik-Diff Reagent 1, Fixative | Thermofisher | 9990705 | Fixes cells to be stained by H&E. |
| Kwik-Diff Reagent 3, Methylene Blue | Thermofisher | 9990707 | Methylene Blue staining that stains the nucleus. |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma/Aldrich | P0781-100ML | Penicillin-Streptomycin is the most commonly used antibiotic solution for culture of mammalian cells. Additionally it is used to maintain sterile conditions during cell culture. |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermofisher | 61870036 | RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) was originally developed to culture human leukemic cells in suspension and as a monolayer. RPMI 1640 medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells, including HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, astrocytes, and carcinomas. Helps grow Jurkat T cells fast and efficiently. |
| Stratagene UV Stratalinker 1800 UV Crosslinker | Cambridge Scientific | 16659 | The Stratalinker UV crosslinker is designed to induce apoptosis, crosslink DNA or RNA to nylon, nitrocellulose, or nylon-reinforced nitrocellulose membranes. |
| Teledyne T400 ultraviolet light photometer | Teledyne API | T400 | The Model T400 UV Absorption analyzer uses a system based on the Beer-Lambert law for measuring low ranges of ozone in ambient air. |
| Teledyne T703 Ozone calibrator | Teledyne API | T703 | Provides feedback control of the UV lamp intensity, assuring stable ozone output. |
References
- Puttur, F., Gregory, L. G., Lloyd, C. M. Airway macrophages as the guardians of tissue repair in the lung. Immunology and Cell Biology. , (2019).
- Gregoire, M., et al. Impaired efferocytosis and neutrophil extracellular trap clearance by macrophages in ARDS. European Respiratory Journal. 52 (2), (2018).
- Fan, E. K. Y., Fan, J. Regulation of alveolar macrophage death in acute lung inflammation. Respiratory Research. 19 (1), 50 (2018).
- Michlewska, S., McColl, A., Rossi, A. G., Megson, I. L., Dransfield, I. Clearance of dying cells and autoimmunity. Autoimmunity. 40 (4), 267-273 (2007).
- Bhattacharya, J., Westphalen, K. Macrophage-epithelial interactions in pulmonary alveoli. Seminars in Immunopathology. 38 (4), 461-469 (2016).
- Donnelly, L. E., Barnes, P. J. Defective phagocytosis in airways disease. Chest. 141 (4), 1055-1062 (2012).
- Morimoto, K., Janssen, W. J., Terada, M. Defective efferocytosis by alveolar macrophages in IPF patients. Respiratory Medicine. 106 (12), 1800-1803 (2012).
- Vandivier, R. W., et al. Dysfunctional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibits phagocytosis of apoptotic cells with proinflammatory consequences. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 297 (4), L677-L686 (2009).
- Grabiec, A. M., et al. Diminished airway macrophage expression of the Axl receptor tyrosine kinase is associated with defective efferocytosis in asthma. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 140 (4), 1144-1146 (2017).
- Chen, W., Frank, M. E., Jin, W., Wahl, S. M. TGF-beta released by apoptotic T cells contributes to an immunosuppressive milieu. Immunity. 14 (6), 715-725 (2001).
- Gao, Y., Herndon, J. M., Zhang, H., Griffith, T. S., Ferguson, T. A. Antiinflammatory effects of CD95 ligand (FasL)-induced apoptosis. Journal of Experimental Medicine. 188 (5), 887-896 (1998).
- O’Brien, B. A., Fieldus, W. E., Field, C. J., Finegood, D. T. Clearance of apoptotic beta-cells is reduced in neonatal autoimmune diabetes-prone rats. Cell Death and Differentiation. 9 (4), 457-464 (2002).
- Shen, Z. X., et al. Mineralocorticoid Receptor Deficiency in Macrophages Inhibits Atherosclerosis by Affecting Foam Cell Formation and Efferocytosis. Journal of Biological Chemistry. 292 (3), 925-935 (2017).
- Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue Repair, and Tolerance to Infection. Frontiers in Immunology. 9, 1777 (2018).
- Hamon, R., et al. Bushfire smoke is pro-inflammatory and suppresses macrophage phagocytic function. Science Reports. 8 (1), 13424 (2018).
- Angsana, J., Chen, J., Liu, L., Haller, C. A., Chaikof, E. L. Efferocytosis as a regulator of macrophage chemokine receptor expression and polarization. European Journal of Immunology. 46 (7), 1592-1599 (2016).
- Karaji, N., Sattentau, Q. J. Efferocytosis of Pathogen-Infected Cells. Frontiers in Immunology. 8, 1863 (2017).
- Brouckaert, G., et al. Phagocytosis of necrotic cells by macrophages is phosphatidylserine dependent and does not induce inflammatory cytokine production. Molecular Biology of the Cell. 15 (3), 1089-1100 (2004).
- Gonzalez-Guevara, E., et al. Exposure to ozone induces a systemic inflammatory response: possible source of the neurological alterations induced by this gas. Inhalation Toxicology. 26 (8), 485-491 (2014).
- Robertson, S., et al. CD36 mediates endothelial dysfunction downstream of circulating factors induced by O3 exposure. Toxicological Sciences. 134 (2), 304-311 (2013).
- Kilburg-Basnyat, B., et al. Specialized Pro-Resolving Lipid Mediators Regulate Ozone-Induced Pulmonary and Systemic Inflammation. Toxicological Sciences. 163 (2), 466-477 (2018).
- Jakab, G. J., Spannhake, E. W., Canning, B. J., Kleeberger, S. R., Gilmour, M. I. The effects of ozone on immune function. Environ Health Perspect. 103 Suppl 2, 77-89 (1995).
- Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone. Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).
- Nayak, D. K., Mendez, O., Bowen, S., Mohanakumar, T. Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages. Journal of Visualized Experiments. 10 (134), (2018).
- Tao, H., et al. Macrophage SR-BI mediates efferocytosis via Src/PI3K/Rac1 signaling and reduces atherosclerotic lesion necrosis. Journal of Lipid Research. 56 (8), 1449-1460 (2015).
- Coe, L. M., et al. FGF-23 is a negative regulator of prenatal and postnatal erythropoiesis. Journal of Biological Chemistry. 289 (14), 9795-9810 (2014).
- Yong, W. K., Abd Malek, S. N. Xanthohumol induces growth inhibition and apoptosis in ca ski human cervical cancer cells. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. , 921306 (2015).
- Van de Laar, L., et al. Yolk Sac Macrophages, Fetal Liver, and Adult Monocytes Can Colonize an Empty Niche and Develop into Functional Tissue-Resident Macrophages. Immunity. 44 (4), 755-768 (2016).
- Lavin, Y., et al. Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment. Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).
- Beattie, L., et al. Bone marrow-derived and resident liver macrophages display unique transcriptomic signatures but similar biological functions. Journal of Hepatology. 65 (4), 758-768 (2016).
- Svedberg, F. R., et al. The lung environment controls alveolar macrophage metabolism and responsiveness in type 2 inflammation. Nature Immunology. , (2019).
- Crowther, J. E., et al. Pulmonary surfactant protein a inhibits macrophage reactive oxygen intermediate production in response to stimuli by reducing NADPH oxidase activity. Journal of Immunology. 172 (11), 6866-6874 (2004).
- Silveyra, P., Floros, J. Genetic variant associations of human SP-A and SP-D with acute and chronic lung injury. Frontiers in Bioscience. 17, 407-429 (2012).
- Schagat, T. L., Wofford, J. A., Wright, J. R. Surfactant protein A enhances alveolar macrophage phagocytosis of apoptotic neutrophils. Journal of Immunology. 166 (4), 2727-2733 (2001).
- Gomez Perdiguero, E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
- Nebbioso, A., et al. Time-resolved analysis of DNA-protein interactions in living cells by UV laser pulses. Scientific Reports. 7 (1), 11725 (2017).
- Novak, Z., et al. Efficacy of different UV-emitting light sources in the induction of T-cell apoptosis. Photochemistry and Photobiology. 79 (5), 434-439 (2004).
- Park, Y. J., et al. PAI-1 inhibits neutrophil efferocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (33), 11784-11789 (2008).
- Kleeberger, S. R., Reddy, S., Zhang, L. Y., Jedlicka, A. E. Genetic susceptibility to ozone-induced lung hyperpermeability: role of toll-like receptor 4. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 22 (5), 620-627 (2000).
- Wesselkamper, S. C., Chen, L. C., Kleeberger, S. R., Gordon, T. Genetic variability in the development of pulmonary tolerance to inhaled pollutants in inbred mice. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 281 (5), L1200-L1209 (2001).
