Otophagic ve Proteasomal Akı'da Diurnal Ritimlerin Ölçülmesi
Summary
Protein katabolizmindeki biyolojik ritimleri otofaji ve fare karaciğerinde proteozom yoluyla ölçme protokolümüzü tanımlıyoruz.
Abstract
Hücreler istenmeyen proteinlerve diğer malzeme geri dönüşüm için çeşitli yöntemler kullanır, lysosomal ve non-lysosomal yollar da dahil olmak üzere. Protein katabolizmasının birincil lizozomal olmayan yöntemi ubikitin-proteozom sistemi iken, başlıca lizozom-bağımlı yol otofaji olarak adlandırılır. Model organizmalar üzerinde yapılan son çalışmalar, hem otofaji hem de ubikitin-proteozom sisteminin aktivitesinin gün boyunca sabit olmadığını, bunun yerine günlük (sirkadiyen) ritme göre değiştiğini göstermektedir. Protein cirosu biyolojik ritimleri ölçmek için yeteneği hücresel kalite kontrolü nasıl elde edilir anlamak ve ilgi belirli proteinlerin dinamiklerini anlamak için önemlidir. Burada protein cirosunun sirkadiyen bileşenini yakalayan otophagic ve proteasomal akı in vivo’nun ölçülmesi için standart laştırılmış bir protokol salıyoruz. Protokolümüz, fare işleme, doku işleme, fraksiyonve başlangıç malzemesi olarak fare karaciğeri kullanarak otofatik akı nicelliği için ayrıntıları içerir.
Introduction
Sirkadiyen ritimler, biyolojik fonksiyonda doğa boyunca belirgin olan günlük, öngörülebilir varyasyonları ifade eder. Her biyolojik ölçekte varolurlar, uyku-uyanıklık döngüleri gibi makroskopik davranışlardan biyomoleküllerin ritmik bolluğu gibi moleküler fenomenlere kadar. Son yıllarda sirkadiyen ritim ler üzerine yapılan araştırmalar, sirkadiyen ritim üretimi için kritik öneme sahip “saat genlerinin” keşfi ile dönüştürülmüştür. Saat gen nakavt farelerde çalışmalar metabolizma1gibi zamansal olarak organize çekirdek hücresel süreçler sirkadiyen ritimleri için merkezi bir rol ortaya koymuştur. Sirkadiyen ritimlerin bunu gerçekleştirme yolları arasında protein katabolizmine zamansal bir yapı vermek tir.
Bizim ki de dahil olmak üzere çeşitli gruplar göstermiştir ki hücresel protein katabolizma için iki ana caddeleri, otofaji ve ubikiquitin-proteozom sistemi, diurnal ritimleri tabidir2,3,4,5. Otofaji, protein katabolizmasının lizozom bağımlı kolunu temsil eder. kanal (şaperon aracılı otofaji)6. Ubikitin-proteozom sistemi ana non-lysozomal yoludur, proteinler poli-ubiquitinated ve daha sonra proteozom içine beslenen, bir makromoleküler degradatif makine sitoplazma ve çekirdek boyunca bulunan7,8. Otophagic ve proteazomal aktivite ritimleri büyük olasılıkla hücresel housekeeping bir rol oynamaktadır, çünkü önemlidir. Sonuç olarak, pre-klinik hastalık modelleri ile uyumlu protein katabolizma günlük salınımları tespit edebilir standart bir prosedür olması değerlidir.
Burada, bizim laboratuvar3,9çalışma için temel olarak hizmet vermiştir fare karaciğer, otophagic akı diurnal varyasyonları ölçmek için protokolümüzü sağlamak. Yöntemimiz bir “ciro tamsadı”10olarak sınıflandırılır, proteolitik aktivite (veya akı) ölçmek için çok sayıda grup tarafından kullanılan bir yaklaşım. Bu yaklaşımda farelere lizozom veya proteozomlara özgü proteaz inhibitörleri verilir ve sabit bir zaman aralığından sonra doku örnekleri alınır. Buna paralel olarak sahte enjeksiyona maruz kalan farelerden doku örnekleri alınır. Doku örnekleri homojenize edilir ve daha sonra biyokimyasal olarak ayrılabilmek için kemikozomla zenginleştirilmiş ve sitoplazmik fraksiyonlar elde edilir. Bu kesirler daha sonra makrootofji belirteçlerine (LC3b ve p62) özgü antikorlar veya proteazomal substratlar (poli-ubiquitinated protein) kullanılarak batı lekeleme yoluyla paralel olarak analiz edilir. Zamanla, proteaz inhibitörleri enjekte edilen hayvanlar normalde geri dönüştürülmüş olacak proteinleri birikir. Sonuç olarak, proteaz-inhibitör tedavi örneklerindeki marker proteinlerin bolluğu sahte tedavi edilmiş numunelerle karşılaştırılarak ciro oranı çıkarılır. Bu yöntemi gün içinde sabit zaman aralıklarında tekrarlayarak proteozizde sirkadiyen varyasyonları yeniden oluşturmak mümkündür (Şekil 1A).
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokolümüz, farelerde yaygın olarak kullanılan moleküler biyoloji ekipmanlarını kullanarak protein cirosundaki biyolojik ritimleri ölçmenin teknik olarak basit bir aracını tanımlar. Zaman serisi deneylerin uzunluğu ve ilgili biyolojik numunelerin sayısı nedeniyle, farelerin nasıl enjekte edildiği, doku ediniminin zamanlaması ve biyokimyasal işleme ile ilgili tüm deneyboyunca tutarlı olmak önemlidir. Örnekleri. Enjeksiyon, ötenazi ve servikal çıkık adımları, tam ölçekli bir deney başlatma…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma RO1HL135846 ve Çocuk Geliştirme Enstitüsü hibe (PD-II-2016-529) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| 4x SDS PAGE Sample Buffer | Invitrogen | Cat# NP0008 | |
| Bortezomib | EMD Millipore | Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7 | |
| Image Studio | LICOR | N/A | |
| Immobilon-FL PVDF membrane 0.45 micron | Merck Millipore Ltd | Cat# IPFL00010 | |
| K48-linkage Specific Polyubiquitin (D9D5) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | Cat#8081S; RRID:AB_10859893 | |
| LC3a | Boston Biochem | Cat# UL-430 | |
| LC3b antibody | Novus | Cat#NB100-2220; RRID:AB_10003146 | |
| LC3b antibody | Cell Signaling Technology | Cat#2775; RRID:AB_915950 | |
| Leupeptin | Sigma | Cat# L2884; CAS: 103476-89-7 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | Cat# WG1403BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermo Fisher Scientific | Cat# NP0007 | |
| P62-his | Novus | Cat# NBP1-44490 | |
| Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards | Bio-Rad | Cat# 1610373 | |
| Rabbit Anti-p62/SQSTM1 | Millipore-Sigma | Cat#P0067; RRID:AB_1841064 | |
| rhPoly-Ub WT (2-7) (K48) | Boston Biochem | Cat# UC-230 | |
| SDS-PAGE Midi-size Gels | Invitrogen | Cat# WG1403 | |
| SIGMAFAST Protease Inhibitor Tablets | Millipore-Sigma | Cat# S8830 |
References
- Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J. The meter of metabolism. Cell. 134 (5), 728-742 (2008).
- Ma, B. Y., et al. LPS suppresses expression of asialoglycoprotein-binding protein through TLR4 in thioglycolate-elicited peritoneal macrophages. Glycoconjugate Journal. 24 (4-5), 243-249 (2007).
- Ryzhikov, M., et al. Diurnal Rhythms Spatially and Temporally Organize Autophagy. Cell Reports. 26 (7), 1880-1892 (2019).
- Martinez-Lopez, N., et al. System-wide Benefits of Intermeal Fasting by Autophagy. Cell Metabolism. 26 (6), 856-871 (2017).
- Desvergne, A., et al. Circadian modulation of proteasome activity and accumulation of oxidized protein in human embryonic kidney HEK 293 cells and primary dermal fibroblasts. Free Radical Biology and Medicine. 94, 195-207 (2016).
- Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. Autophagy in immunity and inflammation. Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).
- Ciechanover, A. Intracellular protein degradation: from a vague idea thru the lysosome and the ubiquitin-proteasome system and onto human diseases and drug targeting. Cell Death & Differentiation. 12 (9), 1178-1190 (2005).
- Collins, G. A., Goldberg, A. L. The Logic of the 26S Proteasome. Cell. 169 (5), 792-806 (2017).
- Haspel, J., et al. Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay. Autophagy. 7 (6), 629-642 (2011).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
- Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P. Phenotyping Circadian Rhythms in Mice. Current Protocols in Mouse Biology. 5 (3), 271-281 (2015).
- Hughes, M. E., et al. Guidelines for Genome-Scale Analysis of Biological Rhythms. Journal of Biological Rhythms. 32 (5), 380-393 (2017).
