Tecnologia a cellule incapsulate per la consegna dei biologici all'occhio del mouse
Summary
Presentato qui è un protocollo per l’uso dell’alginato come polimero nel microincapsulamento di cellule immortalate per la consegna a lungo termine di biologici agli occhi dei roditori.
Abstract
Molte terapie attuali in fase di sviluppo per le malattie del polo posteriore dell’occhio sono biologiche. Questi farmaci devono essere somministrati frequentemente, in genere tramite iniezioni intravitrali. Le cellule incapsulate che esprimono il biologico di scelta stanno diventando uno strumento per la produzione e il rilascio di proteine locali (ad esempio, tramite la somministrazione di farmaci a lungo termine). Inoltre, i sistemi di incapsulamento utilizzano materiali permeabili che consentono la diffusione di nutrienti, rifiuti e fattori terapeutici all’interno e all’esterno delle cellule. Ciò si verifica mentre si mascherano le cellule dalla risposta immunitaria dell’ospite, evitando la necessità di soppressione del sistema immunitario dell’ospite. Questo protocollo descrive l’uso dell’algerino come polimero nel microincapsulamento accoppiato con il metodo elettrospray come tecnica di microincapsulazione. Le cellule ARPE-19, una linea cellulare RPE umana che nasce spontaneamente, è stata utilizzata in esperimenti di terapia cellulare a lungo termine a causa della sua funzionalità di durata, ed è usato qui per incapsulare e consegnare le capsule agli occhi del topo. Il manoscritto riassume i passaggi per la microincapsulazione cellulare, il controllo qualità e la consegna oculare.
Introduction
Le terapie basate sulle cellule rappresentano tecniche biologiche rivoluzionarie che sono state ampiamente applicate in medicina. Recentemente, sono stati applicati con successo nel trattamento di malattie neurodegenerative, malattie degli occhi, e il cancro. Le terapie cellulari coprono un’ampia gamma di campi, dalla sostituzione cellulare alla somministrazione di farmaci, e questo protocollo si concentra su quest’ultimo. Le microcapsule alginate biodegradabili (MC) hanno dimostrato l’efficacia come sistema di somministrazione e stanno diventando ampiamente utilizzate in campo biomedico. Alginato è stato utilizzato in microincapsulazione grazie al suo semplice processo di gelling, biodegradabilità, eccellente biocompatibilità e stabilità in condizioni in vivo41,2,3.
Il metodo dell’elettrospray, come tecnica di microincapsulamento, è stato utilizzato con successo per incapsulare peptidi e proteine utilizzando algerino (polimero di base) e poli-l-ornitina (polimero di rivestimento secondario). Entrambi i polimeri sono naturalmente trovati e utilizzati per la loro biocompatibilità5,6,7. Tuttavia, la sfida principale nelle terapie basate sulle cellule è la soppressione del sistema immunitario dell’ospite per evitare effetti collaterali causati da farmaci immunosoppressori. La permeabilità delle microcapsule algonate è considerata una proprietà adatta per l’incapsulamento cellulare, che consente la diffusione di nutrienti, rifiuti e fattori terapeutici all’interno e all’esterno delle cellule mascherandoli dalla risposta immunitaria dell’ospite8,9,10.
Nell’occhio, le cellule incapsulate sono state utilizzate negli studi clinici per la consegna costante di biologici (cioè fattori di crescita11,12 e antagonisti fattore di crescita13) per il trattamento della retinite pigmentosa o degenerazione maculare legata all’età. Altri obiettivi come gli inibitori del complemento14 sono attualmente in fase di esplorazione in ambienti preclinici.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questa tecnica di incapsulamento delle cellule è relativamente veloce e facile da eseguire; tuttavia, per ottenere risultati accurati a valle, è necessario tenere presenti alcuni punti. Le cellule devono essere mantenute in coltura in un piatto Petri prima dell’incapsulamento e tenute a giusta confluenza. L’incapsulamento deve essere eseguito in una corretta cappa di ventilazione con flusso d’aria regolato, se possibile. Troppo forte di una corrente d’aria può influenzare la formazione di capsule, soprattutto negli es…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Lo studio è stato sostenuto in parte da sovvenzioni assegnate a B. R. dai National Institutes of Health (R01EY019320), dal Department of Veterans Affairs (RX000444 e BX003050) e dal South Carolina SmartState Endowment.
Materials
| 3 mL Syringe | BD | 309656 | |
| 30 G 1" Blunt needle | SAI Infusion technology | B30-100 | |
| Alginic acid sodium salt, from brown algae | Sigma | A0682 | |
| Atropine Sulfate Ophthalmolic solution (1%) | Akorn | NDC 17478-215-15 | for pupil dilation |
| BD 1 mL Syringe 26 G x 3/8 (0.45 mm x 10 mm) | Becton, Dickinson and Company | DG518105 500029609 REF 309625 | to generate the guide hole |
| Calcium chloride, Anhydrous, granular | Sigma | C1016 | |
| GenTeal Tears | Alcon | NDC 0078-0429-47 | to lubricate the eyes during anesthesia |
| Goniotaire: Hypromellose (2.5%) Ophthalmolic Demulcent Solution (Sterile) | Altaire Pharmaceuticals Inc. | NDC 59390-182-13 | to lubricate the eyes during anesthesia |
| Hamilton Needle/syringe Tip: 27 Gauge, Small Hub RN NDL, custum length (12mm), point style 3, 6/PK | Hamilton | 7803-01 | for intravitreal delivery of capsules |
| Hamilton Syringe: 2.5 µL, Model 62 RN SYR, NDL Sold Separately | Hamilton | 7632-01 | for intravitreal delivery of capsules |
| HEPES buffer, 1M | Fisher Bioreagents | BP299100 | |
| High voltage generator | ESD EMC Technology | ES813-D20 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Thermofisher Scientific | L3224 | |
| L-Ornithine hydrochloride, 99% | Alfa Aesar | A12111 | |
| Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Dexamethasone Ophthalmolic Ointment | SANDOZ | NDC 61314-631-36 | antibiotic to prevent infection after intravitreal injection |
| Phenolephrine Hydrochloride Ophthalmolic Solution (2.5%) | Akorn | NDC 17478-201-15 | for pupil dilation |
| Sodium Chloride | Sigma | S-5886 | |
| Sterile syringe filters, 0.2 um | VWR | 28143-312 | |
| Syringe pump | GRASEBY | MS16A |
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