Summary
Cognate J-Domain proteiner samarbetar med Hsp70 förkläde för att hjälpa till i en myriad av biologiska processer som sträcker sig från proteinvikning till nedbrytning. Här beskriver vi en in situ närhet ligering assay, som gör det möjligt att övervaka dessa transitivt bildade förkläde maskiner i bakteriell, jäst och mänskliga celler.
Abstract
J-Domain proteiner (JDPs) utgör den största och mest varierande Co-Chaperone familjen i eukaryotiska celler. De senaste rönen visar att specifika medlemmar av JDP-familjen kan bilda transienta heterokomplex hos Eukaryoter för att finjustera substrat valet för 70 kDa-värmechockprotein (HSP70) chaperonbaserat protein disaggregas. Den JDP komplex mål akut/kronisk stress inducerade aggregerade proteiner och förmodligen hjälpa till att montera disaggregas genom att rekrytera flera Hsp70s till ytan av protein aggregat. Omfattningen av den protein Quality Control (PQC) nätverk som bildas av dessa fysiskt samverkande JDPs fortfarande i stort sett okarakteriserad in vivo. Här beskriver vi en mikroskopi-baserad in situ protein interaktionsanalys som heter Proximity ligering assay (PLA), som kan kraftfullt fånga dessa transitivt bildade förkläde komplex i olika cellulära avdelningar av eukaryota celler. Vårt arbete utökar sysselsättningen av PLA från mänskliga celler till jäst (Saccharomyces cerevisiae) och bakterier (Escherichia coli), vilket gör ett viktigt verktyg för att övervaka dynamiken i transitivt bildade protein sammansättningar i både prokaryotika och eukaryotiska celler.
Introduction
En stor mängd genomisk information förblir oöversättliga på grund av vår ofullständiga förståelse av cellulära interactomes. Konventionella protein-protein interaktion detektionsmetoder såsom protein Co-immunoprecipitation med/utan kemisk tvärbindning och protein Co-lokalisering, men ofta används, utgör en rad nackdelar. Några av de största nackdelarna är dålig kvantifiering av interaktioner och potentiella införandet av icke-Native bindande händelser. I jämförelse, framväxande närhets-baserade tekniker ger ett alternativ och en kraftfull metod för att fånga proteininteraktioner i celler. Proximity ligering assay (PLA)1, som nu finns som ett egenutvecklat kit, använder antikroppar för att specifikt rikta proteinkomplex baserat på närheten av de samverkande subenheterna.
PLA initieras av bildandet av en byggnadsställning bestående av primära och sekundära antikroppar med små DNA-Taggar (PLA sonder) på ytan av det riktade protein komplexet (figur 1, steg 1-3). Nästa, bestäms av närheten av DNA-taggar, en cirkulär DNA-molekyl genereras via hybridisering med kontakt oligonukleotides (figur 1, steg 4). Bildandet av cirkulär DNA kompletteras av ett DNA ligeringsteg. Den nybildade cirkulära bit av DNA fungerar som en mall för den efterföljande rullande cirkel amplifiering (RCA)-baserade polymeras kedjereaktion (PCR) Primas av en av de konjugerade oligonukleotide taggar. Detta genererar en enkelsträngad concatemeric DNA-molekyl fäst vid protein komplexet via antikropps ställningen (figur 1, steg 6). Den concatemeric DNA-molekylen visualiseras med hjälp av fluorescerande märkta oligonukleotides som hybridiserar till flera unika sekvenser spridda över det förstärkta DNA (figur 1, steg 7)2. Den genererade PLA-signalen, som visas som en fluorescerande punkt (figur 1, steg 7), motsvarar placeringen av det riktade protein komplexet i cellen. Som ett resultat, analysen kunde upptäcka proteinkomplex med hög spatial noggrannhet. Tekniken är inte begränsad till att helt enkelt fånga proteininteraktioner, men kan också utnyttjas för att upptäcka enstaka molekyler eller proteinmodifieringar på proteiner med hög känslighet1,2.
Hsp70 bildar en mycket mångsidig förkläde system fundamentalt viktigt för att upprätthålla cellulära protein homeostas genom att delta i en rad hushållning och stressrelaterade funktioner. Housekeeping aktiviteter av Hsp70 förkläde systemet inkluderar de Novo proteinvikning, protein flyttning över cellulära membran, montering och demontering av proteinkomplex, reglering av protein aktivitet och länka olika protein Folding/ kvalitetskontroll maskiner3. Samma förkläde systemet refolds också felvikt/vecklade proteiner, förhindrar protein aggregation, främjar protein uppdelning och samarbetar med cellulära proteaser för att försämra oboskt missvecklade/skadade proteiner för att underlätta cellulära reparation efter proteotoxiska spänningar4,5. För att uppnå denna funktionella mångfald, den Hsp70 förkläde förlitar sig på samarbetar Co-Chaperones av JDP familjen och nukleotid utbyta faktorer (Nefs) att finjustera Hsp70's ATP-beroende Alloster kontroll av substrat bindning och release3, 6. Vidare, JDP Co-Chaperones spela en viktig roll i valet av substrat för denna mångsidiga förkläde systemet. Medlemmarna i denna familj är indelade i tre klasser (A, B och C) baserat på deras strukturella homologi till prototypen JDP, E. coli dnaj. Klass A JDPs innehåller en N-Terminal J-domän, som samverkar med Hsp70, en glycin-fenylalanin rik region, ett substrat bindande region bestående av en zink finger-liknande region (ZFLR) och två β-Barrel domäner, och en C-Terminal Dimerization domän. JDPs med en N-Terminal J-domän och en glycin-fenylalanin rik region, men saknar ZFLR, falla i klass B. I allmänhet är medlemmar i dessa två klasser inblandade i chaperoning funktioner. Medlemmar som omfattas av catchall klass C, som innehåller JDPs att endast dela J-domän4, rekrytera Hsp70s att utföra en mängd icke-chaperoning funktioner. Den viktiga roll JDPs som utbytbara substrat erkännande "adaptrar" av Hsp70 systemet återspeglas av en utvidgning av familjemedlemmar under evolutionen. Till exempel har människor över 42 distinkta JDP medlemmar4. Dessa jdps fungerar som monomerer, homodimers och/eller homo/hetero oligomerer4,5. Nyligen, ett funktionellt samarbete via övergående komplex formation mellan klass A (t. ex., H. sapiens DNAJA2; S. cerevisiae Ydj1) och klass B (t. ex., H. sapiens DNAJB1; S. cerevisiae Sis1) eukaryotisk jdps rapporterades att främja ett effektivt erkännande av amorfa protein aggregat in vitro-7,8. Dessa blandade klass JDP komplex förmodligen samlas på ytan av aggregerade proteiner för att underlätta bildandet av Hsp70-och Hsp70 + Hsp100-baserade protein disaggregas7,8,9, 10. den kritiska bevisningen för att stödja förekomsten av dessa transitivt bildade blandad klass JDP-komplex i eukaryota celler TILLHANDAHÖLLS med PLA8.
PLA är alltmer anställd för att bedöma proteininteraktioner i Metazoa, främst i däggdjursceller. Här rapporterar vi en lyckad expansion av denna teknik för att övervaka transitivt bildade förkläde komplex i eukaryota och prokaryota encelliga organismer som spirande jäst S. cerevisiae och bakterien E. coli. Viktigt, denna expansion belyser den potentiella användningen av PLA att upptäcka och analysera mikrober som infekterar mänskliga och animaliska celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. HeLa cell förberedelse
- Förbered följande material: PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM na2HPO4, 1,8 mm KH2Po4), pH 7,4; DMEM, kompletterat med 10% FCS och 1% Pen-STREP; 4% PARAFORMALDEHYD i PBS; 0,5% Triton-X100 i PBS; TBS-T (150 mM NaCl, 20 mM Tris, 0,05% Tween), pH 7,4; 0,0001% steril Poly-L-lysin lösning; 10-Tja diagnostiska diabilder; en fuktig kammare; mjukpapper; och Coplin Slide-färgning burkar.
Anmärkning: För att säkerställa optimal bindnings effektivitet bör paraformaldehydslösningar beredas färskt före varje experiment. - Förbered en fuktig kammare genom att täcka botten av en sluten låda med våta vävnader. Placera den fuktiga kammaren vid 37 ° c innan försöket påbörjas, för att säkerställa att kammartemperaturen är vid 37 ° c under inkuberingen av enzymatiska reaktioner.
- Kultur HeLa celler i T25 kolvar, i 5 mL DMEM (hög glukos, glutamat och Natriumpyruvat kompletterat) kompletterat med 10% FCS och 1% Pen-STREP, i en 37 ° c CO2 inkubator innehållande 5% Co2. Separera anhängare celler med 0,05% trypsin-EDTA. Efter tillsats av färska DMEM till separerade celler, räkna celler med hjälp av en cell räknar kammare och växa på diagnostiska bilder inuti en fuktig kammare.
- Sterilisera diagnostiska bilder med UV-bestrålning i en steril cellkultur huva för 30 min.
- Tillsätt 100 μL sterilt filtrerat 0,0001% Poly-L-lysin till varje brunn som krävs för experimentet. Inkubera i 30 min. tvätta bort överskott Poly-L-lysin genom att tvätta varje brunn 3x med 50 μl ultrarent vatten.
- Trypsinize hela celler och tillsätt cirka 15 000 celler till varje brunn. Späd celler vid behov till minst 30-50 μL DMEM per brunn.
- Odla celler i en fuktig kammare inom en 37 ° c 5% Co2 inkubator för cirka 24 h. celler bör vara 60%-80% konfluenta innan pla.
Anmärkning: För hög sammanlänkning minskar absorptionen av reagenser, vilket minskar den erhållna signalen i slutet av protokollet. - Ta bort mediet genom att placera ett silkespapper vid kanten av brunnen. Tvätta brunnarna 3x med 50 μL PBS.
Anmärkning: Celler kan lossas när vätskor tillsätts hårt. Detta kan förhindras genom att inte låta brunnarna torka helt innan du lägger till ny vätska och genom att lägga den nya vätskan försiktigt till kanten av brunnen. - Fixera celler genom att tillsätta 50 μL nyberedd 4% PARAFORMALDEHYD i PBS till varje brunn. Inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Tvätta bilder 3x i PBS. Utför tvättar i en Coplin Slide-färgning burk som innehåller 100 mL PBS. För varje tvätt, inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur utan att skaka.
- Permeabilize cellmembranet genom att dränka bilderna i 100 mL av 0,5% Triton-X100 i PBS i en Coplin Slide-färgning burk. Inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur utan att skaka.
- Tvätta bilder 3x i TBS-T. Utför tvättar i en Coplin Slide-färgning burk som innehåller 100 mL TBS-T. För varje tvätt, inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur utan att skaka.
- Efter den sista tvätten, ta bort överflödig buffert med ett silkespapper. Vid denna punkt cellerna är redo för närhet ligation assay protokoll som kommer att diskuteras i avsnitt 4.
2. S. cerevisiae cell förberedelse
- Förbered följande material: 100 mM KPO4, pH 6,5, kallad tvättbuffert; 37% formaldehyd; 4% PARAFORMALDEHYD i 100 mM KPO4, pH 6,5; 1,2 M sorbitol i 100 mM KPO4, pH 6,5; lyticase lösning (500 μg/mL lyticase, 20 mM β-merkaptoetanol, 100 mM KPO4, pH 6,5); 0,0001% Poly-L-lysin lösning; 1% Triton-X100 i 100 mM KPO4, pH 6,5; 10-Tja diagnostiska diabilder; en fuktig kammare (som bereds enligt steg 1,2). mjukpapper; och Coplin Slide-färgning burkar.
Anmärkning: För att säkerställa optimal bindnings effektivitet bör paraformaldehydslösningar beredas färskt före varje experiment. - Odla en natt kultur i icke-selektiva jästextrakt, Peptone och dextros (YPD) medium vid 30 ° c under skakning.
Anmärkning: Beroende på experimentella krav S. cerevisiae celler kan odlas i syntetiskt komplett (SC) medium eller selektiv syntetiskt minimal (SM) medium i stället. - Späd den stationära kulturen till en OD600 på 0,1 i 20 ml medium. Odla cellerna vid 30 ° c medan skaka tills OD600 når 0,5.
- Överför 20 mL-kulturen till ett 50 mL centrifugeringsrör. Pelleten cellerna genom centrifugering vid 665 x g i 3 min. ta bort supernatanten. Omsuspendera cellerna i 5 mL färskt medium.
- Fixera cellerna genom att tillsätta 550 μL av 37% formaldehyd till kulturen. Inkubera i rumstemperatur i 15 min.
- Pelleten cellerna genom centrifugering vid 665 x g i 3 min. ta bort supernatanten. Omsuspendera pelleten i 1 mL nyberedd 4% PARAFORMALDEHYD i tvättbuffert. Inkubera i 45 min vid rumstemperatur.
- Under inkuberingen, Förbered diagnostiska bilder genom att lägga till 100 μL av 0,01% Poly-L-lysin lösning till varje brunn. Inkubera bilderna i 30 minuter vid rumstemperatur.
- Efter 30 min, tvätta bort överskott Poly-L-Lysin med ultrarent vatten och låt bilderna lufttorka. Torr rutschbanorna är klara för användning.
- Tvätta celler två gånger med 1 mL tvättbuffert. Utför tvättar genom centrifugering av cellerna vid 665 x g i 3 min. ta bort supernatanten och Omsuspendera cellerna i tvättbuffert.
- Pelleten cellerna genom centrifugering vid 665 x g i 3 min. ta bort supernatanten. Omsuspendera cellerna i 1 mL 1,2 M sorbitol i tvättbuffert.
- Pelleten cellerna genom centrifugering vid 665 x g i 3 min. ta bort supernatanten. Omsuspendera pelleten i 250 μL nyberedd Lyticase-lösning för att smälta cellväggen. Inkubera cellerna i Lyticase-lösningen i 15 minuter vid 30 ° c under skakning.
- Efter matsmältningen, tvätta celler 3x genom centrifugering vid 665 x g för 3 min och ta bort supernatanten. Omsuspendera cellerna i 250 μL av 1,2 M sorbitol i tvättbuffert.
Anmärkning: Eftersom cellerna är bräckliga efter cell Väggs nedbrytning, Omsuspendera dem mycket noga för att inte skada cellerna. - Tillsätt 20 μL resuspenderade celler till Poly-L-lysine belagda diabilder. Låt dem fästa på bilderna i 30 min. tvätta bort icke-adherenta celler genom tvättning av brunnarna 3x med 50 μL tvättbuffert.
- Permeabilize cellmembranet genom att tvätta 3x med 50 μL av 1% Triton-X i tvättbuffert.
Anmärkning: Vid denna punkt cellerna är redo för närhet ligering assay protokoll som kommer att diskuteras i avsnitt 4.
3. E. coli -cell beredning
- Förbered följande material: PBS-T (140 mM NaCl, 2 mM KCl, 8 mM K2HPO4, 1,5 mm KH2Po4, 0,05% Tween-20), pH 7,4; lysozym lösning (2 mg/mL lysozym, 25 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM glukos, 10 mM EDTA); 0,0001% Poly-L-lysin lösning; 99% iskall metanol; 99% rumstemperatur metanol; 99% aceton; 10-Tja diagnostiska diabilder; en fuktig kammare (upprättad i steg 1.1.1). mjukpapper; och Coplin Slide-färgning burkar.
- Odla en natt kultur i Luria-Bertani (LB) medium vid 30 ° c under skakning.
- Späd den stationära kulturen till en OD600 på 0,02 i färskt lb-medium. Odla cellerna vid 30 ° c medan skaka tills OD600 når 0,4 för log fas celler.
- Cirka 15 min innan cellerna når en OD600 av 0,4, Förbered Poly-L-lysine belagda diabilder genom att lägga till 100 μL av 0,0001% Poly-L-lysin till varje brunn. Inkubera bilderna i 30 minuter vid rumstemperatur.
- Efter 30 min tvätta bort överskott Poly-L-Lysin med ultrarent vatten och låt glider lufttorka. Torr rutschbanorna är klara för användning.
- När cellerna når en OD600 av 0,4, överför 1 ml av kulturen till ett sterilt microcentrifugerör och pellets celler vid 2 650 x g i 2 min.
- Omsuspendera cellerna i 50 μL LB-medium.
- Fix celler genom att tillsätta 1 mL iskall 99% metanol. Blanda mycket försiktigt för hand. Inkubera celler i 30 min vid-20 ° c.
- Efter fixering Tillsätt 20 μL av cellerna till Poly-L-lysine belagda diabilder. Låt bilderna lufttorka i 30 minuter.
- Tillsätt 50 μL nyberedd lysozym-lösning till varje brunn för att smälta cellväggen. Inkubera i en fuktig kammare i 30 min vid 25 ° c.
- Ta bort lysozym-lösningen från brunnarna genom att tillsätta ett silkespapper i kanten på brunnen. Tvätta diabilder 3x i 100 mL PBS-T. Utför varje tvätt i en Coplin Slide-färgning burk för 30 s, utan att skaka.
- Ta bort tvättbuffert från bilderna genom att knacka på bilderna på ett mjukpapper.
- Permeabilize cellmembranen genom att tillsätta 50 μL av 99% metanol till varje brunn. Inkubera i 1 min vid rumstemperatur.
- Ta bort metanol genom att placera ett silkespapper till kanten av brunnen.
- Tillsätt 50 μL av 99% aceton till varje brunn. Inkubera i 1 min.
- Ta bort överflödig aceton genom att placera ett silkespapper till kanten av brunnen. Låt bilderna lufttorka. Vid denna punkt cellerna är redo för närhet ligering assay protokoll som kommer att diskuteras i avsnitt 4.
4. analys av närhets ligation
- Förbered följande material: blockerande buffert; Utspädnings buffert för antikroppar. Tvättbuffert "A" – (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,05% Tween-20) pH 7,4; Tvättbuffert "B" – (200 mM Tris, 100 mM NaCl) pH 7,4; Anti-kanin sekundär antikropp PLUS; Sekundär anti-mus-antikropp MINUS; 5x ligering buffert; Ligase 5x Amplifieringsbuffert (orange: λex 554 nm; λEM 576 nm); polymeras ultrarent vatten; och monteringsmedel innehållande DAPI.
Anmärkning: PLA-detektionsreagenser finns även i de gröna varianterna (λex 495 nm, λEM 527 nm), röd (λex 594 nm; λEM 624 nm), farred (λex 644 nm; λEM 669 nm) eller brightfield (pepparrotperoxidas (HRP) konjugerat). - Blockera cellerna genom att lägga till en droppe blockerande buffert i varje brunn. Inkubera i 30 min vid 37 ° c i en fuktig kammare.
- Bered antikropps lösningar genom att späda lager antikroppar i utspädnings buffert för antikroppar. För varje brunn krävs 40 μL antikropps lösning.
- Ta bort blockeringsbuffert genom att placera ett silkespapper vid kanten av brunnen. Tillsätt 40 μL antikropp utspädd i antikroppsputten till varje brunn. Inkubera i 60 min i en fuktig kammare vid 37 ° c eller över natten vid 4 ° c.
- Ta bort antikroppslösningen från brunnarna genom att placera ett silkespapper i kanten av brunnen. Tvätta diabilder 2x i 100 mL tvättbuffert "A" i en Coplin Slide-färgning burk i 5 min, utan att skaka.
- Under tvätt stegen, späd 5x sekundära antikropps sonder, anti-kanin PLUS & anti-mus MINUS (arten specificitet av sonderna beror på de primära antikroppar som används), i antikropp utspädning buffert. Bered 40 μL antikropps lösning per brunn.
- Tillsätt 40 μL sekundär antikropps lösning till varje brunn. Inkubera i 60 min vid 37 ° c i en fuktig kammare.
- Avlägsna sekundär antikropps lösning från brunnarna genom att placera ett silkespapper i kanten av brunnen. Tvätta diabilder 2x i 100 mL tvättbuffert "A" i en Coplin Slide-färgning burk i 5 min, utan att skaka.
- Under tvätten bereds 40 μl ligationsblandning per brunn, genom att blanda 8 μl 5x ligationsbuffert, 31 μl ultrarent vatten och 1 μl Ligase.
- Tillsätt 40 μL ligationsblandning i varje brunn. Inkubera i 30 min vid 37 ° c i en fuktig kammare.
- Ta bort ligationsblandningen från brunnarna genom att placera ett silkespapper vid kanten av brunnen. Tvätta diabilder 2x i 100 mL tvättbuffert "A" i en Coplin Slide-färgning burk för 2 min, utan att skaka.
- Under tvätena förbereder 40 μL amplifieringsblandning per brunn, genom att blanda 8 μL 5x amplifieringslösning, 31,5 μL ultrarent vatten och 0,5 μL av polymeras.
Anmärkning: Den 5x amplifieringen innehåller fluorescerande sonder. Skydda denna blandning från ljus. Skydda också bilderna från ljus under var och en av följande steg. Om du använder genomskinlig Coplin Slide-färgning burkar och fuktiga kammare, Linda in dem i aluminiumfolie. - Tillsätt 40 μL amplifieringsblandning per brunn. Inkubera i 100 min vid 37 ° c i en fuktig kammare.
- Avlägsna förstärknings blandningen från brunnarna. Tvätta diabilder 2x i 100 mL tvättbuffert "B" i en Coplin Slide-färgning burk för 10 min utan att skaka.
- Tvätta diabilder i 100 ml tvättbuffert "B" utspädd 1:100 i ultrarent vatten i en Coplin Slide-färgning burk för 30 s.
- Tillsätt 20 μL DAPI som innehåller monteringsmedel per brunn till diabilderna. Stäng diabilder med en täckslip och tätnings glas med nagellack.
- Om avbildning, inkubera omedelbart DAPI som innehåller monteringsmedel för 10 – 15 min, medan skyddat från ljus. Om inte, förvara bilderna vid-20 ° c i upp till 1 vecka, skyddade från ljus.
5. detektering
- Använd konfokalmikroskopi att förvärva bilder av HeLa, S. cerevisiae och E. coli celler med 20x/0.8 na, 63x/1.4 na och 100X/1.4 na plan apochromat mål, respektive. Excitera DNA-färgade DAPI med en 405 nm pulsad diodlaser. För PLA signal (för denna studie) Excite med en 561 nm Solid-State laser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Våra tidigare in vitro-studier med renade proteiner visade att en delmängd av Human klass A och klass B JDPs bildar övergående blandade klass JDP-komplex för att effektivt kunna rikta ett brett spektrum av aggregerade proteiner och möjligen underlätta monteringen av Hsp70-baserade protein disaggregas7. Vi använde PLA för att avgöra om blandad klass (A + B) JDP komplex förekommer i mänskliga livmoderhalscancer celler (HeLa). Human JDPs DNAJA2 (klass A) och DNAJB1 (klass B) riktades mot mycket specifika primära antikroppar och sekundära PLA sonder (figur 2A-C). Utseendet på röd fluorescerande punctae indikerade närvaron av blandade klass DNAJA2 och DNAJB1 komplex i HeLa celler (figur 2C) bekräftar våra tidigare biokemiska fynd7. Varje punktM representerar en individuell protein interaktion händelse i hela cell Cytosol/Nucleus.
Tidigare biokemiska resultat från Förster resonans energiöverföring (FRET), som detekterar protein interaktioner som en avläsning av mängden energi som överförs från en upphetsad givare fluorophore bifogas ett protein till en lämplig acceptor fluorophore ansluten till det andra proteinet, uppgav att liknande blandade klass komplex kan också förekomma mellan jäst JDPs, in vitro-8. Genom att bekräfta våra biokemiska fynd observerade vi bildandet av blandade klass komplex mellan Ydj1 (klass A) och Sis1 (klass B) i encelliga eukaryot S. cerevisiae (Baker ' s jäst) celler med PLA (figur 2F). I jäst, på grund av sin lilla Cellstorlek och återförening av flera punctae, de enskilda fluorescerande prickar som genereras av PLA kan ofta vara mindre distinguishable. En avsevärd minskning av fluorescerande punctae formation observerades efter knockout eller knockdown av samverkande JDPs i både mänskliga och jästceller8, som visar den höga specificitet PLA att fånga dessa Co-Chaperone komplex i olika celltyper. I motsats till sina eukaryota motsvarigheter, den prokaryota (E. coli) jdps saknade förmågan att bilda blandade klass JDP komplex och funktionellt samarbeta för att öka protein disaggregation, in vitro-8. I samförstånd med den biokemiska analysen har vi inte observerat blandad klass JDP-komplex formation mellan bakteriell DnaJ-YFP (klass A) och CbpA-mCherry (klass B), den enda JDPs i E. coli (figur 2i). Men vår PLA setup kunde fånga andra förkläde församlingar som involverar de två jdps. Till exempel upptäckte vi förkläde komplex mellan dnaj-yfp och dnak (bakteriell HSP70) (figur 2L) och cbpa-mcherry och dnak8 (data som inte visas). Dessa två bakteriella förkläde komplex kännetecknas i stor utsträckning både in vitro-och in vivo8,11,12 vilket bekräftar vår PLA resultat. Tillsammans visar dessa observationer förmågan hos PLA att robust fånga transitivt bildade förkläde maskiner i encelliga/flercelliga eukaryota och prokaryota celler. De tekniska kontrollerna saknar en primär antikropp mot en av de samverkande JDPs/Chaperones, men som innehåller både mus och kanin härledda sekundära PLA sonder, visade liten eller ingen bakgrund fluorescens signal (figur 2a, B, D, E, G, H, J, K) indikerar en brist på falsk positiv signal förstärkning i vår experimentella inställning.
Figur 1: schematisk representation av de kronologiska stegen i analysen av närhets ligation. (1) komplex mellan protein A och protein B. (2) bindning av primära (1 °) antikroppar (grön och ljusbrun) till proteiner A och B. De två primära antikropparna måste höjas i olika värdarter (t. ex. mus, kanin eller get). (3) primära antikroppar erkänns av artspecifika sekundära (2 °) antikroppar kovalent fästa med DNA oligo-Taggar (PLA-sonder). (4) när proteiner A och B är i komplexa, är de bundna PLA sonderna i nära närhet för att underlätta DNA oligos att hybridisera med kontakt DNA-strängar, vilket resulterar i bildandet av en cirkulär DNA-molekyl. Därefter underlättar en DNA-Ligase sammanfogning av DNA-strängar tillsammans genom att katalysera bildandet av en fosfodiesterbindning. (5) initiering av den rullande cirkeln amplifiering (RCA) av den cirkulära DNA-molekylen av en bakteriell DNA-polymeras vid 37 ° C. RCA-reaktionen grundmålas av en av de antikroppskonjugerade DNA oligo-taggarna. (6) generering av en enkelsträngad concatemeric DNA-molekyl som är kopplad till en av de sekundära antikropparna. (7) hybridisering av fluorescerande-märkta komplementära oligonukleotidsonder till en unik repetitiv sekvens i den concatemeric DNA-molekylen. Efter hybridisering steg, kan den concatemeric DNA-molekylen visualiseras som en ljus fluorescerande prick på platsen för den riktade proteinkomplex i fasta celler. Botten betecknar prokaryotika och eukaryotiska celltyper där PLA tekniken är tillämplig. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Molekylära förkläde församlingar fångas av PLA i prokaryotika och eukaryotiska celler. (A-C) detektion av blandade klass JDP-komplex bildade mellan DNAJA2 (klass A) och DNAJB1 (klass B) i humana livmoderhalscancer cellinjer hela. PLA utförs med (a) anti-DNAJA2 antikropp ensam (negativ teknisk kontroll); B) enbart anti-DNAJB1-antikroppar (negativ teknisk kontroll). C) anti-DNAJB1 och anti-DNAJA2 antikroppar tillsammans. Utseendet på flera fluorescerande prickar i panel C (positiv signal) indikerar närvaron av proteinkomplex som bildas mellan DNAJA2 och DNAJB1. Varje röd fluorescerande punkt/punktM representerar en enda interaktion. Nuklei (DNA) färgas med DAPI (cyan). (D-F) Detektion av blandade klass JDP-komplex bildade mellan Ydj1 (klass A) och Sis1 (klass B) i S. cerevisiae -celler. D) PLA som endast utförs med anti-Ydj1-antikropp (negativ teknisk kontroll). E) PLA som endast utförs med anti-Sis1-antikropp (negativ teknisk kontroll). (F) PLA utförs tillsammans med anti-Ydj1 och anti-Sis1 antikroppar. Den positiva fluorescerande signalen betecknar närvaron av Ydj1 och Sis1 komplex i S. cerevisiae. Jäst kärnor färgas med DAPI (cyan). (G-L) Detektion av förkläde komplex bildas mellan prokaryota Hsp70 (dnak) och jdps (dnaj och cbpa) i E. coli -celler. På grund av avsaknaden av specifika primära antikroppar mot prokaryota JDPs, E. coli dnaj (klass A) och cbpa (klass B) var märkta med Yfp respektive mcherry. (G, J) PLA utförs med anti-YFP ensam (negativ teknisk kontroll); (H) PLA som utförs med anti-mcherry ensamt (negativ teknisk kontroll). (I) PLA utförs med anti-yfp och anti-mcherry antikropp. Avsaknaden av fluorescerande dot formation indikerar ingen komplex formation mellan DnaJ och CbpA. K) PLA som utförs med enbart anti-dnak-antikroppar (negativ teknisk kontroll). (L) PLA utförs med anti-yfp och anti-dnak antikroppar tillsammans. Den positiva fluorescerande signalen indikerar komplex formation mellan DnaK och DnaJ. Bakteriell DNA färgas med DAPI (cyan). Förutom att innehålla en enda primär antikropp, alla negativa tekniska kontroller utfördes i närvaro av respektive sekundära PLA sonder. Skalstreck = 10 μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Co-immunoprecipitation och co-lokalisering baserade metoder har använts som långvariga metoder för att karakterisera protein assembler. Upptäckten av transitivt bildade specifika förkläde komplex är en stor utmaning med sådana konventionella metoder, och som ett resultat, tidigare fynd är till stor del begränsad till kvalitativa tolkningar. Den cell lysis-baserade Co-immunoprecipitation tekniker kräver ofta cross-linking att stabilisera protein-protein interaktioner. Cell Lys ökar risken för att störa transitivt bildade förkläde komplex, medan cross-linking kan införa icke-infödda interaktioner, särskilt driven av den inneboende "stickiness" av de flesta Chaperones. Vid analys av Hsp70 förkläde systemet med hjälp av co-immunoprecipitation, potentiella artefakter kan uppstå från (a) höga uttrycks nivåer av förkläde och (b) Löslighet frågor som rör membran eller protein aggregat bunden förkläde Machineries. Förutom, Co-immunoprecipitation-baserade tekniker ger ingen information om cellulära lokalisering av fångade protein sammansättningar, vilket kan vara viktigt för att avgränsa de tillhörande funktionerna. Nackdelarna med att använda Co-immunoprecipitation tekniker är något reducerad i Co-lokalisering-baserade metoder som bevarar protein lokalisering information. Samtidig lokalisering av två eller flera proteiner kan dock tyda på antingen direkt protein-proteinassociation eller uppdelning av proteiner i samma mikrodomän i celler. Därför är co-lokalisering analys i bästa fall spekulativa i att förutsäga protein interaktioner och saknar någon närhet värde. På grund av bulk och urskillningslösa detektering av riktade proteiner, är tekniken mycket begränsad i att studera specifika protein sammansättningar i celler. Detta är särskilt problematiskt när det riktade proteinet (s) kan parallellt bilda ett brett spektrum av olika protein sammansättningar som i fallet med Hsp70 förkläde systemet. Jämfört med dessa konventionella metoder är PLA en mer förfinad in situ-teknik utvecklad för att kraftfullt detektera och kvantifiera inhemska protein föreningar i celler med bevarad protein lokaliseringsinformation. En protein interaktion avslöjas genom denna analys baserad på närheten (ca 10-30 Nm) mellan de riktade proteinerna. PLA är "avstämbar" på så sätt att räckvidden för närhets avståndet kan reduceras för att få en strängare avläsning genom att (a) minska längden på de oligonukleotidtaggar som fästs vid PLA-sonderna och/eller (b) konjugera taggarna direkt till primära antikroppar. Försiktighet bör iakttas vid tolkning av en positiv PLA-signal. Helst bör en protein interaktion bekräftas med två eller flera oberoende metoder. Intensiteten av den fluorescerande signalen i PLA är inte så deterministiskt relaterade till protein klusterstorlek eller separation avstånd mellan de samverkande proteiner som är fallet med FRET. Emellertid, PLA har en hög grad av specificitet och känslighet, och kan även användas för att analysera mycket lågt förekommande proteiner såsom tillväxtfaktorer eller cytokiner och deras interaktioner i sällsynta celltyper eller kliniska prover13.
Den Hsp70 förkläde partners med flera Co-Chaperones (t. ex., jdps och Nefs) under sin cellulära livstid14 att köra distinkta biologiska funktioner. Det stora antalet sannolika Hsp70-JDP-NEF-maskinkonfigurationer och deras dynamiska beteende i celler har till stor del hämmat en detaljerad förståelse av de specifika rollerna för dessa förkläde-maskiner. Biologiska verktyg som tillåter selektiv spårning av distinkta Hsp70 sammansättningar är därför krävs för att dissekera den övergripande ledningar av detta förkläde nätverk i celler. Den övergående bildade JDP-JDP och JDP-Hsp70 förkläde komplex7 fångades effektivt i celler med PLA, vilket indikerar att denna teknik är lämplig för att studera molekylära interaktioner med höga dissociationskonstanter (t. ex. > 3 μm Kd ). Men i det nuvarande arbetet, analysen används främst som ett "Ja" eller "nej" typ binär indikator för förkläde interaktion, användarna kan använda denna teknik för att få semi-kvantitativa avläsningar av graden av interaktion genom att digitalt räkna fluorescens signalintensitet15. På grund av den icke-linjära amplifieringen av PLA-signalen bör dock försiktighet iakttas vid tolkningen av PLA-data på ett kvantitativt sätt16. Trots ovannämnda fördelar har denna metod vissa begränsningar. En av de största nackdelarna med PLA är att analysen kräver cellfixering vilket till stor del begränsar dess förmåga att lösa temporala dynamik av proteinkomplexering i levande celler. I jämförelse, in vivo FRET17 eller bioluminescence resonans energiöverföring (Bret)18 möjliggör övervakning av liknande protein interaktioner i en spatio-temporal sätt i levande celler med relativt mindre närhet värden (< 10 nm). I motsats till PLA, en FRET signal uppvisar en strikt linjär korrelation med protein uttrycks nivåer16 gör FRET Guldstandarden i kvantitativ analys av proteininteraktioner. Men till skillnad från FRET beroende av den gåtfulla orientering faktor κ2, pla påverkas inte av orienteringen av PLA sonder, vilket ökar sannolikheten för att fånga ett proteinkomplex19. När det gäller användarvänlighet kräver FRET och BRET unik expertis, vilket i allmänhet begränsar tillgängligheten för dessa metoder till det bredare forskarsamhället. Ytterligare, båda dessa tekniker kräver modifiering av samverkande proteiner genom att fästa skrymmande Luminescent/fluorescerande protein taggar som potentiellt kan störa proteinfunktion och komplex formation.
Följande steg (1-4) kräver noggrann övervägande för lyckad implementering av PLA i celler. (1) val av antikroppar: den kommersiellt tillgängliga PLA-satsen är kompatibel med primära antikroppar som höjs mot mus, kanin och get. PLA kräver mycket specifika primära antikroppar som inte binder till av mål. Dessutom är det viktigt att välja primära antikroppar som är kompatibla med tillämpningar såsom immunohistokemi (IHC), enzymkopplad immunosorbent assay (ELISA), och/eller immunoprecipitation (IP) för att säkerställa att antikropparna kan känna igen antigena aminosyresekvenser exponerade på ytan av vikta proteiner. Före användning rekommenderas starkt att test av alla primära antikroppar för deras specificitet. Detta kan utföras via Western blot analys av hela cellen Lysates. I de fall där de riktade proteinerna har homologs med små variationer i storlek och sekvens likhet (t. ex. Hsp70 och JDP paralogs), kan specificiteten hos antikropparna testas med genknockdown/knockout-metoder eller genom sondering mot renade homologs att utesluta alla potentiella kors igenkänning. Om lämpliga antikroppar inte finns tillgängliga kan de riktade proteinerna märkas med epitoper som har antikroppar av godtagbar kvalitet (Figur 2F). (2) fixering och permeabilisering av celler: en behandling av 4% PARAFORMALDEHYD och 0,1-0,5% Triton-X100 kan användas för att fastställa och permeabilize celler, respektive. Användningen av 4% PARAFORMALDEHYD är en bättre behandling för att bevara protein-protein interaktioner och cellulära ultrastruktur jämfört med fixativ villkor sysselsätter 99% metanol20,21,22. Fastställande celler med 99% metanol, emellertid, ger mindre cytoplasmiska bakgrunds färgning, och kanske är mer lämplig för specifika fall såsom detektion av cytoskelettet associerade protein sammansättningar21,22. Effektiv permeabilisering av både plasmamembranet och organellmembraner för att öka tillgängligheten till antikroppar kan uppnås med nonjontensiden Triton-X100. Triton-X100 kan dock inte specifikt avlägsna proteiner från plasmamembranet23,24. Därför, för analys av protein sammansättningar i samband med cellulära membran, alternativa rengöringsmedel såsom saponin eller digitonin som riktar steroler till permeabilize membran kan appliceras21,22,25. (3) störning av cellväggen: innan membran permeabilisering, ett ytterligare steg som involverar specifika lytiska enzymer behövs för att öka penetrerbarheten av antikroppar i celltyper med cellväggar (t. ex. svampar, växt-och bakterieceller). Till exempel använde vi lyticase, som försämrar β-glukan för att störa cellväggen hosS. cerevisiae26. På samma sättE. colicellväggen stördes med hjälp av lysozym, ett enzym som riktar sig till peptidoglykaner27,28. Cell Väggs sammansättningen och den lytiska enzym känsligheten varierar med olika tillväxtförhållanden26och kultur sammanflödet29,30. Därför kan koncentrationen av de lytiska enzymerna och digestionstiderna variera och försiktighet måste iakttas för att förhindra över-eller under nedbrytning av celler. Efter cell Väggs nedbrytning, cellerna är relativt bräcklig och kräver trängsel agenter såsom sorbitol för dem att förbli intakt under tvätt stegen. (4) DNA-amplifiering: DNA-ligationen och den rullande cirkeln PCR reaktionssteg är känsliga för temperatur och luftfuktighet svängningar. För att säkerställa en robust DNA-amplifiering och reproducerbarhet av analysen måste dessa reaktioner utföras vid 37 ° c i en fuktighets kammare. Viktigare, de bearbeta cellerna bör förhindras att torka ut när du utför analysen för att undvika icke-specifik antikropp bindning och DNA amplifiering händelser som kan leda till en ökad i bakgrunds signalen.
Alla saker, kräver genomförandet av denna analys inte unik expertis och sofistikerad instrumentering. Den framgångsrika övervakningen av JDP-JDP och JDP-Hsp70 förkläde-komplex illustrerar den potentiella tillämpningen av denna teknik för att spåra transitivt bildade protein sammansättningar i alla celltyper. Vår implementering av tekniken i jäst och bakterier avsevärt ökar tillämpligheten av PLA att studera olika biologiska processer medieras av olika protein sammansättningar i ett brett spektrum av organismer. Vidare belyser vårt arbete PLA som ett lovande nytt protein interaktions verktyg för att studera evolutionära förändringar som sker på molekylär nivå över arter8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
NBN stöds av ett särskilt rekryterings bidrag från Monash University medicinska omvårdnad och hälsovetenskaper med finansiering från delstatsregeringen i Victoria och den australiska regeringen. Vi tackar Bernd Bukau (ZMBH, Heidelberg University, Tyskland) och harm H. Kampinga (Institutionen för biomedicinsk vetenskap av celler & Systems, University of Groningen, Nederländerna) för deras ovärderliga stöd och utbyte av reagenser, Holger Lorenz (ZMBH Imaging Facility, Heidelbergs universitet, Tyskland) för sitt stöd med konfokalmikroskopi och bildbehandling, och Claire Hirst (ARMI, Monash University, Australien) för kritisk läsning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Formaldehyde | Merck | 103999 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201 | |
| anti-DNAJA2 antibody | Abcam | ab157216 | |
| anti-DNAJB1 Antibody | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-450 | |
| anti-DnaK antibody | In house | ||
| anti-mCherry antibody | Abcam | ab125096 | |
| anti-Sis1 Antibody | Cosmo Bio Corp | COP-080051 | |
| anti-Ydj1 antibody | StressMarq Biosciences | SMC-150, | |
| anti-YFP antibody | In house | ||
| Coplin slide-staining jar | Sigma-Aldrich | S5516 | |
| Diagnostic slides | Marienfeld | 1216530 | |
| DMEM | Thermo-Fischer | 31966021 | |
| DuoLink In Situ Detection Reagents Orange | Sigma-Aldrich | DUO92007 | |
| DuoLink In Situ Mounting Medium + DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
| DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS | Sigma-Aldrich | DUO92004 | |
| DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | |
| DuoLink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma-Aldrich | DUO82049 | |
| Fetal Calf Serum | Thermo-Fischer | 10082147 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | 62971 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fischer | 15070063 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P47-07 | |
| Sorbitol | Sigma-Aldrich | S7547 | |
| Triton-X100 | Merck | 108643 | |
| Trypsin | Thermo-Fischer | 25300096 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Zymolase 100T / / Lyticase | United States Biological | Z1004 |
References
- Soderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
- Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Review of Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).
- Mayer, M. P., Gierasch, L. M. Recent advances in the structural and mechanistic aspects of Hsp70 molecular chaperones. Journal of Biological Chemistry. 294 (6), 2085-2097 (2019).
- Kampinga, H. H., Craig, E. A. The HSP70 chaperone machinery: J proteins as drivers of functional specificity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 579-592 (2010).
- Nillegoda, N. B., Bukau, B. Metazoan Hsp70-based protein disaggregases: emergence and mechanisms. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).
- Bracher, A., Verghese, J. The nucleotide exchange factors of Hsp70 molecular chaperones. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).
- Nillegoda, N. B., et al. Crucial HSP70 co-chaperone complex unlocks metazoan protein disaggregation. Nature. 524 (7564), 247-251 (2015).
- Nillegoda, N. B., et al. Evolution of an intricate J-protein network driving protein disaggregation in eukaryotes. Elife. 6, (2017).
- Kirstein, J., et al. In vivo properties of the disaggregase function of J-proteins and Hsc70 in Caenorhabditis elegans stress and aging. Aging Cell. 16 (6), 1414-1424 (2017).
- Nillegoda, N. B., Wentink, A. S., Bukau, B.
- Chae, C., Sharma, S., Hoskins, J. R., Wickner, S. CbpA, a DnaJ homolog, is a DnaK co-chaperone, and its activity is modulated by CbpM. Journal of Biological Chemistry. 279 (32), 33147-33153 (2004).
- Kityk, R., Kopp, J., Mayer, M. P. Molecular Mechanism of J-domain-Triggered ATP Hydrolysis by Hsp70 Chaperones. Molecular Cell. 69 (2), 227-237 (2018).
- Söderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45 (3), 227-232 (2008).
- Benschop, J. J., et al. A consensus of core protein complex compositions for Saccharomyces cerevisiae. Molecular Cell. 38 (6), 916-928 (2010).
- Jung, J., et al. Quantifying RNA-protein interactions in situ using modified-MTRIPs and proximity ligation. Nucleic Acids Research. 41 (1), (2013).
- Mocanu, M. M., Váradi, T., Szöllosi, J., Nagy, P. Comparative analysis of fluorescence resonance energy transfer (FRET) and proximity ligation assay (PLA). Proteomics. 11 (10), 2063-2070 (2011).
- Sekar, R. B., Periasamy, A. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).
- Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. Investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer. Journal of Visualized Experiments. 87, (2014).
- Nagy, P., Szöllosi, J. Proximity or no proximity: that is the question – but the answer is more complex. Cytometry. 75 (10), 813-815 (2009).
- Hoetelmans, R. W., et al. Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).
- Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
- Stadler, C., Skogs, M., Brismar, H., Uhlen, M., Lundberg, E. A single fixation protocol for proteome-wide immunofluorescence localization studies. Journal of Proteomics. 73 (6), 1067-1078 (2010).
- Goldenthal, K. L., Hedman, K., Chen, J. W., August, J. T., Willingham, M. C. Postfixation detergent treatment for immunofluorescence suppresses localization of some integral membrane proteins. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 813-820 (1985).
- Schrader, M., Almeida, M., Grille, S. Postfixation detergent treatment liberates the membrane modelling protein Pex11beta from peroxisomal membranes. Histochemistry & Cell Biology. 138 (3), 541-547 (2012).
- Willingham, M. C., Yamada, S. S., Pastan, I. Ultrastructural antibody localization of alpha2-macroglobulin in membrane-limited vesicles in cultured cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4359-4363 (1978).
- Aguilar-Uscanga, B., Francois, J. M. A study of the yeast cell wall composition and structure in response to growth conditions and mode of cultivation. Letters in Applied Microbiology. 37 (3), 268-274 (2003).
- Romaniuk, J. A., Cegelski, L. Bacterial cell wall composition and the influence of antibiotics by cell-wall and whole-cell NMR. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370, 1679 (2015).
- Salazar, O., Asenjo, J. A.
- Cunningham, A. F., Spreadbury, C. L. Mycobacterial stationary phase induced by low oxygen tension: cell wall thickening and localization of the 16-kilodalton alpha-crystallin homolog. Journal of Bacteriology. 180 (4), 801-808 (1998).
- Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiological Reviews. 57 (2), 383-401 (1993).
