Live Cell Imaging om de dynamiek van de metafase timing en het lot van de cel na de mitotische spindel perturbations te beoordelen
Summary
Hier presenteren we een protocol om de dynamiek van spindel vorming en mitotische progressie te beoordelen. Onze toepassing van time-lapse Imaging stelt de gebruiker in staat om cellen te identificeren in verschillende stadia van mitose, sporen en identificeren mitotische defecten, en analyseren spil dynamiek en mitotische cel lot bij blootstelling aan anti-mitotische drugs.
Abstract
Live Cell time-lapse Imaging is een belangrijk hulpmiddel in celbiologie dat inzicht geeft in cellulaire processen die anders zouden kunnen worden vergeten, verkeerd begrepen of verkeerd geïnterpreteerd door de analyse van de vaste cel. Hoewel de vaste celbeeldvorming en-analyse robuust en voldoende zijn om cellulaire stationaire toestand te observeren, kan deze worden beperkt bij het definiëren van een tijdelijke volgorde van gebeurtenissen op cellulair niveau en is slecht uitgerust om de voorbijgaande aard van dynamische processen te beoordelen, waaronder mitotische progressie. Live-celbeeldvorming daarentegen is een welsprekend hulpmiddel dat kan worden gebruikt om cellulaire processen in de loop van de tijd op het eencellige niveau te observeren en heeft de capaciteit om de dynamiek van processen vast te leggen die anders slecht zouden worden weergegeven in vaste celbeeldvorming. Hier beschrijven we een aanpak voor het genereren van cellen die fluorescentisch gelabelde markers van chromatine en microtubuli dragen en hun gebruik in Live Cell Imaging benaderingen om de metafase-chromosoom uitlijning en de mitotische uitgang te bewaken. We beschrijven Imaging-gebaseerde technieken om de dynamiek van spil vorming en mitotische progressie te beoordelen, inclusief de identificatie van cellen in verschillende stadia in mitose, identificatie en tracking van mitotische defecten, en analyse van spil dynamiek en mitotische cel lot na de behandeling met mitotische remmers.
Introduction
Op afbeeldingen gebaseerde analyse van vaste cellen wordt vaak gebruikt om de celpopulatie veranderingen te beoordelen in reactie op verschillende verstoringen. In combinatie met celsynchronisatie, gevolgd door de verzameling en imaging van seriële tijdpunten, kunnen dergelijke benaderingen worden gebruikt om een cellulaire opeenvolging van gebeurtenissen voor te stellen. Niettemin, vaste celbeeldvorming is beperkt in die tijdelijke relaties worden geïmpliceerd voor een populatie en niet aangetoond op het niveau van individuele cellen. Op deze manier, terwijl vaste celbeeldvorming en-analyse voldoende zijn om robuuste fenotypes en steady-state veranderingen te observeren, is de mogelijkheid om voorbijgaande veranderingen na verloop van tijd te detecteren en veranderingen die alleen een subpopulatie van de cellen beïnvloeden, onvolmaakt. Live-celbeeldvorming daarentegen is een welsprekend hulpmiddel dat kan worden gebruikt om cellulaire en subcellulaire processen binnen een enkele cel of cellulaire populatie te observeren, na verloop van tijd en zonder de hulp van synchronisatie benaderingen die zelf invloed kunnen hebben op cellulair gedrag 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6.
De vorming van een bipolaire mitotische spil is essentieel voor de juiste chromosoomsegregatie tijdens celdeling, resulterend in twee genetisch identieke dochtercellen. Defecten in de mitotische spil structuur die corrupte mitotische progressie en het compromitteren van de getrouwheid van chromosoomsegregatie kan resulteren in catastrofale celsplitsingen en verminderde levensvatbaarheid van de cel. Om deze reden, mitotische gifstoffen die spindel vorming veranderen zijn veelbelovende Therapeutics om de snelle proliferatie van kankercellen7,8,9te beperken. Niettemin, vaste celanalyse van spil structuur na de toevoeging van mitotische gifstoffen is beperkt in zijn vermogen om het dynamische proces van spindel vorming te beoordelen en kan niet aangeven of waargenomen veranderingen in spil structuur permanent zijn of in plaats van voorbijgaande en kan worden overwonnen om succesvolle celdeling toe te staan.
In dit protocol beschrijven we een benadering voor het beoordelen van de dynamiek van mitose na spindle-perturbaties door Live-celbeeldvorming. Met behulp van de htert vereeuwigd RPE-1 cellijn ontworpen om een RFP-Tagged histone 2b uit te drukken om chromatine te visualiseren, samen met een met EGFP gelabelde α-tubuline om microtubuli te visualiseren, de timing van metafase-chromosoom uitlijning, anafhase aanvang, en uiteindelijk het lot van de mitotische cellen wordt beoordeeld aan de hand van visuele aanwijzingen van chromosoom beweging, verdichting en nucleaire morfologie.
Protocol
Representative Results
Discussion
De tijdelijke resolutie die wordt geleverd door de time-lapse Imaging zorgt voor de visualisatie en beoordeling van sequentiële cellulaire gebeurtenissen binnen enkele cellen. Benaderingen die gebruikmaken van cellulaire synchronisatie gevolgd door het verzamelen en fixeren van cellen op opeenvolgende tijdstippen zijn beperkt in die vergelijkingen worden uiteindelijk gemaakt tussen populaties van cellen. In contexten waar de cellulaire respons op verstoringen niet uniform kan zijn, of waar het proces dat wordt gevisuali…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DLM wordt ondersteund door een NSF GRFP. ALM wordt ondersteund door financiering uit de Smith Family Award for Excellence in biomedisch onderzoek.
Materials
| 0.05% Trypsin | Gibo-Life sciences | 25-510 | A serine protease used to release adherent cells from culture dishes |
| 15ml centrifuge tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| 20x CFI Plan Fluor objective | Nikon | For use in Live-cell imaging to visualize both bright field and fluorescence | |
| 293T Cells | ATCC | CRL-3216 | For use in retroviral transfection; used in step 1.1 |
| a-tubulin-EGFP | Addgene | various numbers | Expression vector for alpha tubulin fused to a green fluorescent protein tag; for use in the visualization of tubulin in live-cell imaging: commercially available through addgene and other vendors |
| Alisertib | Selleckchem | S1133 | Small molecule inhibitor of the mitotic kinase Aurora A. Stock concentration is prepared at 10mM in DMSO, and used at a final concentration of 100nM. |
| Blasticidin | Invitrogen | A11139-03 | Antibiotic selection agent; used to select for a-tub-EGFP expressing cells |
| C02 | Airgas | For use in cell culture and live cell imaging | |
| Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3) | Chroma | 49005 | Single band filter set; excitation wavelength 545nm with 25nm bandwidth and emission at 605nm wavelength with 70nm bandwidth; for visualization of H2B-RFP |
| Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2) | Chroma | 49002 | Single band filter set; excitation wavelength 470nm with 40nm bandwidth and emission at 525nm wavelength with 50nm bandwidth; for visualization of GFP-tubulin |
| disposable glass Pastuer pipets, sterilized | Fisher Scientific | 13-678-6A | For use in aspirating cells |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibo-Life sciences | 11965-084 | Cell culture medium for growth of RPE-1 and 293T cells |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibo-Life sciences | 10438-026 | Cell culture medium supplement |
| Lipofectamine 3000 and p3000 | Invitrogen | L3000-015 | Lipid based transfection reagent for transfection of plasmids; used in 1.1.4 |
| Multi well Tissue Culture dishes | Corning | various | for use in cell culture, transfection/infection, and live cell imaging |
| Nikon Ti-E microscope | Nikon | Inverted epifluorescence microscope for use in live-cell imaging | |
| NIS Elements HC | Nikon | Version 4.51 | Image acquisition and analysis software; used in sections 3 & 4 |
| OPTI-MEM | Gibo-Life sciences | 31985-070 | Reduced serum medium for cell transfection; used in step 1.1.3 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibo-Life sciences | 15140-122 | antibiotic used in cell culture medium |
| phosphate bufferred saline (PBS) | Caisson labs | PBP06-10X1LT | sterile saline solution for use with cell culture |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | Lentiviral VSV-G envelope expression construct; used in step 1.1.4 |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | Cationic polymer used to enhane viral infection efficiency; used in step 1.1.10 |
| psPAX | Addgene | 12260 | 2nd generation lentiviral packaging plasmid; used in step 1.1.4 |
| Puromycin | Invitrogen | ant-pr-1 | Antibiotic selection agent; used to select for RFP-H2B expressing cells |
| RFP- Histone 2B (H2B) | Addgene | various numbers | Expression vector for red fluorescent protein-tagged histone 2B; for use in the visualization of chromatin in live-cell imaging: commercially available through Addgene and other vendors |
| RNAi Max | Invitrogen | 13778-150 | Lipid based transfection reagent for transfection of siRNA constructs |
| RPE-1 cells | ATCC | CRL-4000 | Human retinal pigment epithelial cell line |
| Tissue culture dish 100x20mm | Corning | 353003 | for use in culturing adherent cells |
| Zyla sCMOS camera | Nikon | Camera attached to the micrscope, used for capturing images of cells |
References
- Szuts, D., Krude, T. Cell cycle arrest at the initiation step of human chromosomal DNA replication causes DNA damage. Journal of Cell Science. 117, 4897-4908 (2004).
- Gayek, A. S., Ohi, R. CDK-1 Inhibition in G2 Stabilizes Kinetochore-Microtubules in the following Mitosis. PLoS One. 11, e0157491 (2016).
- Mackay, D. R., Makise, M., Ullman, K. S. Defects in nuclear pore assembly lead to activation of an Aurora B-mediated abscission checkpoint. The Journal of Cell Biology. 191, 923-931 (2010).
- Cimini, D., Fioravanti, D., Salmon, E. D., Degrassi, F. Merotelic kinetochore orientation versus chromosome mono-orientation in the origin of lagging chromosomes in human primary cells. Journal of Cell Science. 115, 507-515 (2002).
- Kwon, M., et al. Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes. Genes & Development. 22, 2189-2203 (2008).
- Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38, 2-16 (2006).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells?. Journal of Cell Science. 122, 2579-2585 (2009).
- van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M. Antimitotic drugs in the treatment of cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 76, 1101-1112 (2015).
- Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand. Cell Death and Diseases. 3, 411 (2012).
- Martin, M., Akhmanova, A. Coming into Focus: Mechanisms of Microtubule Minus-End Organization. Trends in Cell Biology. 28, 574-588 (2018).
- Maiato, H., Logarinho, E. Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification. Nature Cell Biology. 16, 386-394 (2014).
- Vitre, B. D., Cleveland, D. W. Centrosomes, chromosome instability (CIN) and aneuploidy. Current Opinion in Cell Biology. 24, 809-815 (2012).
- Godinho, S. A., Pellman, D. Causes and consequences of centrosome abnormalities in cancer. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369, (2014).
- Navarro-Serer, B., Childers, E. P., Hermance, N. M., Mercadante, D., Manning, A. L. Aurora A inhibition limits centrosome clustering and promotes mitotic catastrophe in cells with supernumerary centrosomes. Oncotarget. 10, 1649-1659 (2019).
- Conte, N., et al. TACC1-chTOG-Aurora A protein complex in breast cancer. Oncogene. 22, 8102-8116 (2003).
- Schumacher, J. M., Ashcroft, N., Donovan, P. J., Golden, A. A highly conserved centrosomal kinase, AIR-1, is required for accurate cell cycle progression and segregation of developmental factors in Caenorhabditis elegans embryos. Development. 125, 4391-4402 (1998).
- Asteriti, I. A., Giubettini, M., Lavia, P., Guarguaglini, G. Aurora-A inactivation causes mitotic spindle pole fragmentation by unbalancing microtubule-generated forces. Molecular Cancer. 10, 131 (2011).
- Chan, J. Y. A clinical overview of centrosome amplification in human cancers. International Journal of Biological Sciences. 7, 1122-1144 (2011).
- Kramer, A., Maier, B., Bartek, J. Centrosome clustering and chromosomal (in)stability: a matter of life and death. Molecular Oncology. 5, 324-335 (2011).
- Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, 278-282 (2009).
- Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells. PLoS One. 4, e6564 (2009).
- Nigg, E. A. Centrosome aberrations: cause or consequence of cancer progression?. Nature reviews, Cancer. 2, 815-825 (2002).
- Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes. Cancer Metastasis Reviews. 28, 85-98 (2009).
- Quintyne, N. J., Reing, J. E., Hoffelder, D. R., Gollin, S. M., Saunders, W. S. Spindle multipolarity is prevented by centrosomal clustering. Science. 307, 127-129 (2005).
- Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
