Time-Lapse 2D Imaging of Phagocytic Activity in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures
Summary
L’activité phagocytique de Macrophage contre des cellules cancéreuses, spécifiquement les cellules mammaires de carcinome de souris 4T1, a été imaged dans cette étude. Le modèle de coculture des cellules vivantes a été établi et observé à l’aide d’une combinaison de microscopie fluorescente et de contraste d’interférence différentielle. Cette évaluation a été imageà l’aide d’un logiciel d’imagerie pour développer une vidéo en accéléré multipoints.
Abstract
Les macrophages tumeur-associés (TAMs) ont été identifiés comme composant important pour la croissance de tumeur, l’invasion, la métastase, et la résistance aux thérapies de cancer. Cependant, les macrophages tumeur-associés peuvent être nocifs à la tumeur selon le microenvironnement de tumeur et peuvent réversiblement modifier leurs caractéristiques phénotypiques en antagonisant l’activité cytotoxique des cellules immunitaires ou en améliorant la réponse antitumorale. Les actions moléculaires des macrophages et leurs interactions avec les cellules tumorales (p. ex., la phagocytose) n’ont pas fait l’objet d’études approfondies. Par conséquent, l’interaction entre les cellules immunitaires (M1/M2-sous-type TAM) et les cellules cancéreuses dans le microenvironnement tumoral est maintenant au centre de la recherche sur l’immunothérapie contre le cancer. Dans la présente étude, un modèle de coculture de cellules vivantes des macrophages induits de M1 et des cellules de carcinome 4T1 mammaires de souris a été développé pour évaluer l’activité phagocytique des macrophages utilisant une fonction vidéo de time-lapse utilisant la microscopie de contraste de phase-contraste, fluorescent, et différentielde de contraste (DIC). La méthode actuelle peut observer et documenter l’imagerie multipoint de cellules vivantes de la phagocytose. La phagocytose des cellules 4T1 par les macrophages M1 peut être observée à l’aide de la microscopie fluorescente avant de tacher les cellules 4T1 avec l’ester de succinimidyl de carboxyfluorescein (CFSE). La publication actuelle décrit comment coculture macrophages et cellules tumorales dans un seul plat d’imagerie, polariser les macrophages M1, et enregistrer les événements multipoints de macrophages engloutissant les cellules 4T1 pendant 13 h de la coculture.
Introduction
Les macrophages sont la première ligne de défense immunitaire et jouent un rôle dans l’orchestration des réponses immunitaires contre les agents pathogènes et les matériaux étrangers, y compris les cellules cancéreuses. Ils sont un phagocyte spécialisé qui détruit et se débarrasse des particules indésirables dans le corps. Les macrophages fournissent des fonctions défensives telles que le dégagement des cellules apoptotiques et des micro-organismes et le recrutement d’autres cellules immunitaires1. Les macrophages peuvent se différencier en deux types différents, les macrophages M1 et M2, en réponse aux signaux environnementaux2. Les macrophages polarisés M1 (c.-à-d. les macrophages activés classiquement) sont activés par l’interféron cytokine -M- (IFN-) et les lipopolysaccharides (LPS) et sont impliqués dans la réponse inflammatoire, le dégagement d’agent pathogène, la phagocytose efficace, et l’immunité tumoricidale3,4. Les macrophages M2 sont étroitement liés aux macrophages tumeur-associés (TAMs) et ont des propriétés anti-inflammatoires et de promotion de tumeur4.
Phagocytosis, dérivé du grec ancien (phagein), signifiant « dévorer », (kytos), signifiant « cellule » et – osis, signifiant « processus »5. La phagocytose est un processus à médiation réceptrice où les phagocytes (y compris les macrophages, les monocytes et les neutrophiles) tuent et engloutissent les agents pathogènes envahissants, nettoient les particules étrangères et déblayent les débris de cellules apoptotiques. Les macrophages tumeur-associés (TAMs) sont trouvés dans le stroma dans différentes tumeurs, y compris le cancer du sein, et ont des fonctions pro-tumorales6,7, ayant pour résultat la résistance à la phagocytose. Le mécanisme détaillé de la phagocytose de cellules de tumeur par des macrophages n’est pas encore compris.
Cette étude présente une méthode en deux étapes : 1) les cellules mammaires du carcinome de souris 4T1 et les macrophages M1 polarisés sont cocultivés, et 2) l’activité phagocytique des macrophages est évaluée à l’aide de la microscopie vidéo à cellules vivantes. Le colorant fluorescent de CFSE a été employé pour tacher les cellules mammaires de carcinome de souris 4T1. La tache étiquette les cellules 4T1 pour les distinguer des macrophages M1 cocultivés dans un seul plat d’imagerie. LES macrophages RAW 264,7 sont polarisés avec LPS et IFN-MD dans un phénotype M1. Pour assurer une polarisation complète, l’immunostaining avec l’anticorps anti-iNOS conjugué au FITC a été exécuté. Par la suite, une série multipoint d’images en time-lapse a été acquise pour observer de multiples événements, y compris la phagocytose, au sein de la coculture.
Une meilleure compréhension des interactions entre les cellules tumorales et les macrophages peut conduire à l’immunothérapie potentielle du cancer. L’imagerie cellulaire vivante offre une vue détaillée de la dynamique cellulaire en temps réel et a été utilisée pour étudier la migration cellulaire, le dépistage phénotypique, l’apoptose et la cytotoxicité8,9 en neurosciences, en biologie du développement et en découverte de médicaments. Bien que la tumeur proposée dans cette étude soit le cancer du sein, la méthode peut également être appliquée à plusieurs cellules cibles et cellules effectrices distinctes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit exige deux étapes : 1) coculture des cellules mammaires de carcinome de souris 4T1 et des macrophages M1-polarisés, et 2) l’évaluation de l’activité phagocytique de macrophage utilisant la microscopie de time-lapse. La coculture cellulaire vivante est largement utilisée dans les tests de phagocytose et de migration. Le modèle de coculture des cellules vivantes ici est une procédure in vitro simple et adaptable (Figure 2) qui utilise un colorant fluorescent, CFSE, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé financièrement par Geran Putra Berimpak (GBP), Universiti Putra Malaisie: 9542800. Nous tenons à remercier les laboratoires de l’Institut agro-biotechnologique, les laboratoires de Malaisie (ABI) et l’installation d’imagerie par microscopie. Un merci spécial à Mohd Daniel Hazim pour son aide au montage et à l’enregistrement de la vidéo expérimentale pour ce travail.
Materials
| Anti-INOS antibody conjugated FITC | Miltenyi Biotec | REA982 | 150 µg in 1 mL |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Invitrogen | C1157 | 25 mg |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | 10 mg |
| DMEM/high glucose | HyClone | SH30003.04 | 670.0 g |
| Fetal bovine serum | Tico Europe | FBSEU500 | 500 mL |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L4516-1MG | 1 mg |
| Mouse recombinant interferon-gamma | Stemcell Technologies | 78021 | 100 µg |
| Penicillin-streptomycin solution | Cellgro | 30-003-CI | 100 mL |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 pack |
| Trypsin EDTA | Cellgro | 25-052-CI | 1X, 100 mL |
| 1000 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-01-052 | 5000 tips/case |
| 2 mL serological pipette | JET BIOFIL | GSP012002 | Non-pryogenic |
| 200 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-02-302 | 20,000 tps/case |
| 25 cm2 cell culture flask | Corning | CLS430639 | Tissue culture treated |
| Bench top centrifuge | Dynamica | FA15C | Model: Velocity 14R |
| Biological safety fume hood | Nuaire | NU-565-400 | Model: Home/ LabGard® ES TE NU-565 Class II, Type B2 Biosafety Fume Hood |
| CO2/air mixer | Chamlide (Live Cell Instrument) | FC-R-20 | FC-5 (CO2/Air Mixer) with the flow meter |
| Cell scrapper | NEST | 710001 | 220 mm |
| CO2 cell incubator | Panasonic | N/A | Model: MCO-19M(UV) |
| Confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Ti-Eclipse |
| Glass bottom dish | Ibidi | 81218-200 | 35 mm |
| NIS elements software | Nikon Instruments Inc. | Available online download | |
| Pipette controller | CappAid | PA-100 | CappController pipette controller, 0.1-100ml |
| Thermostat | Shinko | Discontinued | JCS-33A 48 x 48 x 96.5mm |
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