半高通量成像方法和数据可视化工具包，用于分析C. elegans胚胎发育
Summary
这项工作描述了一个半高通量协议，允许在一次一夜的运行中同时对80-100 C.elegans胚胎的胚胎发生进行3D延时成像。此外，还包括图像处理和可视化工具，以简化数据分析。这些方法与自定义报告菌株相结合，有助于详细监测胚胎生成。
Abstract
在胚胎发育过程中，胚胎学是系统分析细胞命运规范和形态遗传事件的首要系统。一个挑战是胚胎生成在大约13小时的时间内动态展开;这个半天的时间尺度限制了可以成像的胚胎数量，限制了实验的范围。在这里，我们描述了一个半高通量协议，它允许在一次夜间运行中，以中等时间分辨率、从多达 14 个不同条件对 80-100 个胚胎进行同步 3D 延时成像。该协议非常简单，任何实验室都可以通过具有点访问能力的显微镜进行实施。该协议的效用通过用它来成像两个定制的菌株来演示荧光标记，这些荧光标记经过优化，以可视化细菌层规范和形态生成的关键方面。为了分析数据，构建了一个自定义程序，该程序在所有通道、z 步长和时间点中从更广泛的视野中裁剪单个胚胎，并将每个胚胎的序列保存到单独的 tiff 堆栈中。该程序包括用户友好的图形用户界面 （GUI），通过隔离、预处理和统一定向单个胚胎来简化数据处理，为可视化或自动分析做好准备。还提供了一个 ImageJ 宏，该宏将单个胚胎数据编译为多面板文件，在每个时间点显示每个胚胎的最大强度荧光投影和亮场图像。本文描述的协议和工具通过使用它们来描述胚胎发育的特征，在击倒40个先前描述的发育基因之后;此分析可视化了以前用的分着的发育表型，并揭示了新的表型。总之，这项工作详细介绍了半高通量成像方法，以及裁剪程序和 ImageJ 可视化工具，当与表达信息荧光标记的菌株结合使用时，可以大大加快分析实验胚胎发育。
Introduction
胚胎是机械细胞生物学的重要模型系统，分析细胞命运规范和形态遗传事件，推动胚胎发育1、2、3、4，5，6，7，8，9。 迄今为止，胚胎中细胞级事件和细胞命运规范的大部分特征都是通过相对高的时间分辨率一次进行成像实验（即每10-100s采集一次）表达的胚胎来实现的。荧光标记。尽管这种方法非常适合从秒到几十分钟的事件，但这种方法在技术上对较长过程的特征进行了限制，从小时到天的顺序。从第一次裂解到伸长结束的胚胎发育大约需要10小时。在这个时间尺度，半高通量的方法，将允许同时降低时间分辨率成像（即，在5-20分钟的时间间隔获得）更大的胚胎组，从不同的条件，将开辟一个新的实验范围;例如，进行系统的大规模筛选工作，并分析足够数量的胚胎，以便比较分子扰动的后果。
在这里，我们描述了一种半高通量方法，用于监测C.elegans胚胎的产生，该方法可在一次夜间运行中，在80-100个胚胎中同时进行3D延时成像，从多达14个不同的条件下进行发育。该协议易于实施，任何实验室都可以使用具有点访问功能的显微镜进行操作。此协议中的主要步骤如图1所示。简而言之，胚胎从表达荧光标记的幼体成人中解剖，并将年轻胚胎（2-8细胞阶段）转移到384孔板的孔中进行成像。在这种形式下，相对较小的井尺寸将胚胎漏斗到狭窄的区域，这有助于识别含有多个胚胎的场，以便进行延时成像。为了保持胚胎群的大致同步发育，解剖在冷冻介质中进行，板在冰上保存，这阻止了长达一小时的解剖时间窗口的重大发育。将板转移到显微镜上，胚胎在温度控制室中过夜，间隔20分钟，使用60倍油浸1.35 NA透镜，在2μm步数中收集整个z-范围。50个场，每个包含1-5个胚胎，在一个夜间运行成像。根据所需的实验，可以通过按比例减少成像场的数量来增加时间分辨率（例如，以 5-10 分钟间隔成像）。
有了这个协议，即使是一次通宵运行也能生成大量数据（分布在 50 个领域的 80-100 个胚胎），而大型实验在数据分析方面可能很快变得难以管理。为了便于处理、可视化和简化此数据的分析，构建了一个程序来裁剪和定向胚胎并执行预处理步骤（可选），以及一个用于编译数据以简化查看的 ImageJ 宏。这些程序可用于处理使用传统方法收集的图像，因为它们独立于成像方法，只需要单个亮场平面。第一个程序采用包含多个胚胎（GUI 选项或源代码embryoCrop.py）的 4D 场，或包含多个胚胎（screenCrop.py）的多个 4D 场，紧密裁剪胚胎，并在前后配置中定向它们。这些程序还为用户提供了执行背景减法、漂移校正和衰减校正的选项。生成的文件是统一的预处理，严格裁剪每个胚胎的tiff堆栈，可以修改为自动图像分析。为了简化查看每种条件的所有胚胎，编写了 ImageJ 宏（OpenandCombine_embsV2.ijm），该宏将给定条件中的所有胚胎组装到单个 tiff 堆栈中，并阵列显示景场图像和最大强度投影颜色（RGB）覆盖，并排，每个胚胎。在一对定制菌株中敲除40个先前描述的发育基因后，通过它们来描述胚胎发育的特征，这些基因得到了验证，这些基因表达荧光标记，这些标记经过优化，以可视化细菌层的关键方面规格和形态生成10，11。半高通量胚胎成像协议和图像处理工具共同作用于实现更高的样本数实验和旨在了解发育过程的大规模筛选工作。此外，这些菌株还将为检查分子扰动对胚胎生成的影响提供一种有效的方法。
Protocol
Representative Results
Discussion
这项工作描述了一套工具和方法，开发，使更大规模的努力，以分析基因在胚胎发育在C.elegans的功能。我们的半高通量方法允许在一次实验中以 20 分钟分辨率对胚胎发育进行 3D 延时成像，用于 80-100 个胚胎。虽然此协议可以适用于任何所需的标记菌株，但此工作演示了使用两种定制菌株来监测胚胎生成过程中事件的方法的潜力：（1） 胚层报告菌株，其中组织特定启动子驱动荧光组蛋白的?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.D.O.得到了美国国家普通医学研究所赞助，加州大学圣地亚哥分校机构研究和学术职业发展奖（NIH/IRACDA K12 GM068524）。A.D.和K.O.得到了路德维希癌症研究所的支持，该研究所也为他们提供了用于支持这项工作的研究资金。我们感谢安德鲁·奇斯霍尔姆在这个项目的早期阶段的建议，罗纳德·比格斯在最初方法开发阶段后为这个项目做出了贡献，戴夫·詹金斯和安迪·肖为小分子发现提供支持和访问组的高含量成像系统。
Materials
| Aspirator Tube Assembly | Drummond Scientific | 2-000-000 | |
| Calibrated Pipette (25mL) | Drummond Scientific | 2-000-025 | |
| Cell Voyager Software | Yokogawa Electric Corp | Included with CV1000 | |
| Conical Tube (15 mL ) | USA Scientific | 1475-0501 | |
| CV1000 Microscope | Yokogawa Electric Corp | CV1000 | |
| Depression slide (3-well) | Erie Scientific | 1520-006 | |
| Dissection Microscope | Nikon | SMZ-645 | |
| Eppendorf Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5811 07336 | |
| ImageJ/FIJI | Open Source | https://imagej.net/Fiji | |
| M9 Buffer | Lab Prepared | https://openwetware.org/wiki/M9_salts | |
| Microcentrifuge Tube (1.5 mLl) | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Microseal F-foil Seal | Bio-Rad | MSF1001 | |
| NGM Plates | Lab Prepared | http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214 | |
| Scalpel #15 | Bard Parker | REF 371615 | |
| Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom | Greiner Bio-One | 781855 | |
| Tetramisole Hydrochloride | Sigma Aldirch | T1512-10G | |
| Tweezers, Dumont #3 | Electron Microscopy Sciences | 0109-3-PO | |
| U-PlanApo objective (10× 0.4NA) | Olympus | 1-U2B823 | |
| U-PlanApo objective (60× 1.35 NA) | Olympus | 1-U2B832 |
References
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