Messung der Auswirkungen von Bakterien und Chemikalien auf die Darmdurchlässigkeit von Caenorhabditis elegans
Summary
Dieses Protokoll beschreibt, wie die Darmdurchlässigkeit von Caenorhabditis elegansgemessen wird. Diese Methode ist hilfreich für die biologische Grundlagenforschung zur Darmgesundheit im Zusammenhang mit der Wechselwirkung zwischen Darmbakterien und ihrem Wirt und für das Screening, um probiotische und chemische Wirkstoffe zu identifizieren, um leckartigedarme Syndrome und entzündliche Darmerkrankungen zu heilen.
Abstract
In lebenden Organismen ist die Darmhyperpermeabilität ein ernstes Symptom, das zu vielen entzündlichen Darmerkrankungen (IBDs) führt. Caenorhabditis elegans ist ein nichtmammalisches Tiermodell, das aufgrund seiner kurzen Lebensdauer, Transparenz, Kostenwirksamkeit und des Mangels an tierethischen Fragen weithin als Assay-System verwendet wird. In dieser Studie wurde eine Methode entwickelt, um die Auswirkungen verschiedener Bakterien und 3,3′-Diindolylmethane (DIM) auf die Darmdurchlässigkeit von C. elegans mit einem Hochdurchsatz-Bildanalysesystem zu untersuchen. Die Würmer wurden mit verschiedenen Darmbakterien infiziert oder 48 h lang mit DIM kobehandelt und über Nacht mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-Dextran gefüttert. Anschließend wurde die Darmdurchlässigkeit durch Vergleich der Fluoreszenzbilder und der Fluoreszenzintensität in den Schneckenkörpern untersucht. Diese Methode kann auch das Potenzial haben, probiotische und pathogene Darmbakterien zu identifizieren, die Diedarmdurchlässigkeit im Tiermodell beeinflussen und ist wirksam für die Untersuchung der Auswirkungen von schädlichen oder gesundheitsfördernden Chemikalien auf die Darmdurchlässigkeit und Darmgesundheit. Dieses Protokoll hat jedoch auch einige erhebliche Einschränkungen auf genetischer Ebene, insbesondere zur Bestimmung, welche Gene zur Kontrolle von Krankheiten verändert werden, da diese Methode hauptsächlich zur phänotytypischen Bestimmung verwendet wird. Darüber hinaus beschränkt sich diese Methode darauf, genau zu bestimmen, welche pathogenen Substrate Entzündungen verursachen oder die Durchlässigkeit des Darms der Würmer während der Infektion erhöhen. Daher sind weitere eingehende Studien, einschließlich der Untersuchung des molekulargenetischen Mechanismus mit mutierten Bakterien und Nematoden sowie der chemischen Komponentenanalyse von Bakterien, erforderlich, um die Funktion von Bakterien und Chemikalien bei der Bestimmung der Darmdurchlässigkeit vollständig zu bewerten.
Introduction
Darmdurchlässigkeit gilt als eine der Hauptbarrieren im Zusammenhang mit der Darmmikrobiota und Schleimhautimmunität und wird wahrscheinlich von mehreren Faktoren beeinflusst werden, wie Darm-Mikrobiota-Modifikationen, Epithel-Inbußen, oder Schleimschicht-Änderungen1. Jüngste Arbeiten haben über wirksame Protokolle zur Messung der Darmdurchlässigkeit kultivierter menschlicher Darmzellen berichtet, indem die Fluoreszenzflussraten in der Darmzellschicht2analysiert werden, aber weniger Forschungsarbeiten stellen ein geeignetes Verfahren zur Messung der Darmdurchlässigkeit in Nematoden, insbesondere in C. elegans,durch Verwendung von FITC-dextran Färbung dar.
Es gibt zwei repräsentative Protokolle zur Messung der Darmdurchlässigkeit in C. elegans mit Nilrot3 und Erioglindinatrium (oder dem Schlumpftest)4,5. In diesem Protokoll verwendeten wir FITC-Dextran (durchschnittliches Molekulargewicht 10.000), das ein viel höheres Molekulargewicht hat als Nilrot (MW = 318,37) und Erioglindinatrium (MW = 792,85). FITC-Dextran ähnelt eher als Nilrot- oder Erioglin-Dinatriumfarbstoffe tatsächlichen makromolekularen Nährstoffen wie Kohlenhydraten, die durch die Darmschicht absorbiert werden. Die Darmdurchlässigkeit von C. elegans, die mit Erioglindinatrium (blauer Schlumpffarbstoff) gefüttert werden, kann ohne Fluoreszenzmikroskopie einfach ausgewertet werden. Im Schlumpftest ist die quantitative Analyse der Darmdurchlässigkeit jedoch aufgrund fehlender Standardisierung schwierig und sollte manuell bewertet werden4,5. Im Falle des Nilrot-Assays färbt Nilrot auch Lipidtröpfchen in Zellen, die die genaue Bestimmung der Darmdurchlässigkeit in C. elegans6stören können. Die vorliegenden Protokolle ermöglichen eine schnelle und präzise quantitative Analyse der Darmdurchlässigkeit bei C. elegans, die mit verschiedenen Darmbakterien und Chemikalien behandelt werden, und vermeiden dabei unspezifische Lipidfärbungen.
C. elegans ist ein typisches Modell in biologischen Bereichen aufgrund seines erschwinglichen Preises, einfacher Manipulation, begrenzter tierethischer Fragen und kurzer Lebensdauer, was für schnelle Experimente von Vorteil ist7. Insbesondere nach der Veröffentlichung des gesamten C. elegans Genoms wurden fast 40% der Gene im C. elegans Genom als orthologous für Gene gefunden, die menschliche Krankheiten verursachen8. Darüber hinaus ermöglicht der transparente Körper die Beobachtung im Inneren des Organismus, was für die Erforschung zellulärer Ereignisse und für Fluoreszenzanwendungen in der Zellbiologie von Vorteil ist, z.B. Stammzellfärbung mit DAPI oder Immunhistochemie9. C. elegans wird oft als Versuchstier verwendet, um die Wechselwirkung zwischen der Darmmikrobiota und dem Wirt zu untersuchen; darüber hinaus, C. elegans wird verwendet, um gesundheitsfördernde probiotische Bakterien zu überprüfen10,11,12 sowie diätetische Chemikalien zur Förderung der Darmgesundheit13,14.
Pseudomonas aeruginosa und Enterococcus faecalis sind bekannte Darmbakterien, die das Magen-Darm-System negativ beeinflussen, insbesondere die Kolonepithelzellen des Darmtraktes15,16. Daher ist die Messung der Darmdurchlässigkeit, die von diesen Bakterien ausgelöst wird, für das Screening und die Entwicklung neuer Medikamente notwendig, die sich erholen und die Schäden reduzieren können, die durch bakterielle Entzündungen und Infektionen verursacht werden. In diesem Protokoll haben wir die Auswirkungen dieser Darmbakterien auf die Darmdurchlässigkeit von C. elegansgetestet.
Wir berichten auch über ein optimiertes Protokoll zur Prüfung von Chemikalien auf die Darmdurchlässigkeit von C. elegans. Zu diesem Zweck verwendeten wir 3,3′-Diindolylmethane (DIM) als Modellchemikalie, da DIM eine bioaktive Metabolitverbindung ist, die aus Indol-3-Carbinol gewonnen wird, das in Brassica-Lebensmittelpflanzen vorhanden ist und nachweislich therapeutische Wirkungen auf IBD bei Mäusen17,18hat. Darüber hinaus entdeckten wir vor kurzem, dass DIM die Darmdurchlässigkeitsfunktionsstörung sowohl in kultivierten menschlichen Darmzellen als auch im Modell Nematode C. elegans19verbessert.
In dieser Studie haben wir drei verschiedene experimentelle Bedingungen verwendet. Zuerst haben wir die Auswirkungen der verschiedenen Bakterien, P. aeruginosa und E. faecalis, auf die Darmdurchlässigkeit gemessen (Abbildung 1). Zweitens haben wir die Auswirkungen von lebender und hitzeinaktivierter P. aeruginosa auf die Darmdurchlässigkeit gemessen (Abbildung 2). Drittens haben wir die Auswirkungen von DIM (einer Modellchemikalie) auf die Darmdurchlässigkeit von C. elegans gemessen, die mit P. aeruginosa gefüttert werden (Abbildung 3).
Ziel dieser Studie war es, optimierte Protokolle zu entwickeln, die die Darmdurchlässigkeit von C. elegansmessen, die durch die Behandlung mit verschiedenen Darmbakterien sowie mit Chemikalien verändert wird.
Protocol
Representative Results
Discussion
Durch die Verwendung dieser neuen Methode zur Bestimmung der Darmpermeabilität in C. elegans, die automatisierte Fluoreszenzmikroskopie und quantitative Bildanalyse kombiniert, können die Unterschiede, die durch Darmmikroorganismen oder Chemikalien verursacht werden, in vivo bestimmt werden, insbesondere im Darm von C. elegans. Dieses Protokoll ist nützlich für Darmdurchlässigkeitsuntersuchungen und gilt für viele Aufgaben, wie die Bestimmung der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) unter Stressbedin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde von einem Intramural Research Grant des Korea Institute of Science and Technology (2E29563) unterstützt.
Materials
| 3,3’-diindolylmethane | Sigma | D9568 | |
| 90×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10090 | |
| 60×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10060 | |
| Bactor Agar | Beckton Dickinson | REF. 214010 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | F1635 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Becton Dickinson | REF. 237500 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Wild type | |
| Cholesterol | Sigma | C3045 | |
| Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene | Corning Incorporated | REF. 3631 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Enterococcus faecalis KCTC 3206 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 3206 | Falcutative anaerobic |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescein isothiocyanate – dextran | Sigma | FD10S | |
| Harmony software | PerkinElmer | verson 3.5 | |
| Luria-Bertani LB medium | Merck | VM743185 626 1.10285.5000 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Bioreagents | BP2213-1 | |
| Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma | F4680 | |
| Operetta CLS High-Content Analysis System | PerkinElmer | HH16000000 | |
| Peptone | Merck | EMD 1.07213.1000 | |
| Pseudomonas aeruginosa PA01 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 1637 | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
| Stereo Microscope | Nikon, Japan | SMZ800N | |
| Yeast extract | Becton Dickinson | REF. 212750 |
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