Sistema Centrífugo de Contraflujo Automatizado para Procesamiento celular a pequeña escala
Summary
La automatización es clave para aumentar el escalado y la gestión de costos en la fabricación de células. Este manuscrito describe el uso de un dispositivo de procesamiento de células centrífugas de contraflujo para automatizar los pasos de intercambio de búferes y concentración celular para el bioprocesamiento a pequeña escala.
Abstract
La comercialización exitosa de terapias basadas en genes y células requiere procesos de fabricación rentables y escalables. El intercambio de búferes y la concentración del producto son componentes esenciales para la mayoría de los procesos de fabricación. Sin embargo, en las primeras etapas del desarrollo del producto, estos pasos a menudo se realizan manualmente. La centrifugación sin salida manual para el intercambio de búferes es laboriosa, costosa y no escalable. Un sistema automatizado cerrado puede eliminar eficazmente este paso laborioso, pero la implementación puede ser difícil. Aquí, describimos un dispositivo de procesamiento celular recientemente desarrollado que es adecuado para el procesamiento de células a pequeña y mediana escala y tiene como objetivo cerrar la brecha entre el procesamiento manual y la automatización a gran escala. Este protocolo se puede aplicar fácilmente a varios tipos y procesos de células modificando el caudal y la velocidad de centrifugación. Nuestro protocolo demostró una alta recuperación de células con tiempos de procesamiento más cortos en comparación con el proceso manual. Las células recuperadas del proceso automatizado también mantuvieron sus tasas de proliferación. El dispositivo se puede aplicar como un componente modular en un proceso de fabricación cerrado para adaptarse a pasos como el intercambio de búferes, la formulación de células y la criopreservación.
Introduction
El panorama de la medicina moderna se ha transformado rápidamente a través de los recientes desarrollos en terapias genéticas y basadas en células (GCT). Como uno de los campos de más rápido crecimiento en la investigación traslacional, el sector GCT también se enfrenta a desafíos únicos y sin precedentes. Además de los resultados clínicos sólidos, los procesos de fabricación eficientes y rentables son esenciales para el éxito comercial de GCT, que es particularmente difícil de lograr en la fabricación a pequeña escala1. El costo del tiempo, la mano de obra y las garantías de calidad se magnifican cuando cada lote de células solo produce unas pocas dosis para un paciente en lugar de cientos o miles. A diferencia de las terapias celulares alogénicas en las que los procesos de fabricación son más parecidos a la producción de anticuerpos y proteínas recombinantes, las terapias celulares autólogas se producen típicamente como operaciones a pequeña escala1. Como fenómeno relativamente nuevo en la fabricación biofarmacéutica2, las opciones para el procesamiento celular a pequeña escala son actualmente bastante limitadas.
El intercambio de búferes es esencial para la fabricación celular. Es uno de los procesos posteriores donde las células se eliminan de los medios de cultivo y se concentran para la criopreservación o la infusión. Actualmente, la fabricación de células a pequeña escala a menudo aplica procesos similares a los del entorno de investigación académica y se basa en salas limpias especializadas para mantener la esterilidad3. Los procesos manuales aguas abajo a menudo utilizan centrífugas de sobremesa para peletizar y resuspender células para la reducción de volumen y el intercambio de búferes. Estos procesos abiertos son costosos (es decir, trabajo y mantenimiento de salas limpias) y tienen una capacidad de fabricación limitada, que no son ideales para la producción comercial2,3.
La implementación de la automatización se ha propuesto como una solución para mejorar la eficiencia de fabricación y lograr producciones a escala comercial2. La esterilidad no se puede lograr en productos a base de células a través de métodos tradicionales utilizados para los productos biológicos, como la irradiación gamma o la filtración terminal. En su lugar, se despliega un sistema cerrado automatizado para reducir los riesgos de contaminación y los operadores que dependen de salas limpias para mantener la esterilidad4. La automatización de procesos también aborda el problema de la escalabilidad al tener varios sistemas ejecutándose en paralelo (escalado horizontal) o aumentando la capacidad de procesamiento de un dispositivo individual (escalado vertical), lo que a su vez minimiza la variabilidad entre los operadores. Además, el análisis de modelado de costes de terapias autólogas sugiere que la automatización puede reducir el coste de fabricaciónde 5,6. Sin embargo, no se encontró ningún beneficio de costo en un ensayo clínico autólogo de células madre donde se utilizó una plataforma de fabricación automatizada7,lo que sugiere que el costo beneficio de la automatización puede depender del proceso de fabricación individual.
Existen diferentes estrategias en las que la automatización se puede introducir en un proceso de fabricación existente. Esto se puede lograr mediante la implementación de una plataforma totalmente integrada o una cadena de procesamiento modular. Hay varias plataformas totalmente integradas disponibles comercialmente para la fabricación de células autólogas, como CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec), Cocoon (Octane Biotech) y Quantum (Terumo BCT). Estas plataformas integradas, que a menudo se describen como “GMP-in-a-box”, tienen bajas demandas de infraestructura y son fáciles de operar. Sin embargo, la capacidad de fabricación de una configuración totalmente integrada puede estar restringida por la incubadora conectada al sistema. Por ejemplo, la capacidad de cultivo de Prodigy se limita a su cámarade 400 ml 8 y el cartucho Quantum tiene una superficie limitante establecida en 2,1 m2 (equivalente a 120 matraces T175)7, que puede no ser suficiente para pacientes que requieren dosis celulares más altas9,10. Además, Prodigy y Quantum tienen un atributo común que limita su uso: la unidad operativa está ocupada por un solo lote de celdas durante todo el período de expansión de la célula, limitando así el número de lotes que pueden ser fabricados por cada unidad11. El enfoque modular de la automatización es crear una cadena de fabricación con múltiples unidades modulares que simula el proceso de fabricación comercial12,13. Este enfoque, que separa el dispositivo de cultivo del dispositivo de lavado celular, puede maximizar así la eficiencia de fabricación. Un dispositivo de procesamiento ideal sería uno que sea adaptable y escalable a las necesidades de fabricación12.
La tecnología de centrifugación de contraflujo (CFC), que se remonta a la década de 1970, ha tenido una larga historia en el procesamiento celular14. Logra la concentración y separación celular equilibrando la fuerza centrífuga con una fuerza de contraflujo. Típicamente, una suspensión celular entra desde el extremo estrecho de una cámara celular bajo un caudal constante mientras está sujeta a una fuerza centrífuga(Figura 1A). El flujo del fluido se ejerce en la dirección opuesta a la fuerza centrífuga. Esto se conoce como la fuerza de contraflujo, que forma un gradiente dentro de la cámara celular. La fuerza de contraflujo disminuye a medida que la cámara celular se ensancha lejos de la punta de la cámara celular en forma de cono. Las células con mayor densidad y diámetro más grande tienen una mayor tasa de sedimentación, y por lo tanto alcanzan el equilibrio de fuerza hacia la punta de la cámara celular en forma de cono. Las partículas más pequeñas pueden alcanzar el equilibrio hacia la base de la cámara o ser demasiado pequeñas para ser retenidas en la cámara y serán lavadas. La tecnología CFC es principalmente conocida por su aplicación en el procesamiento de productos de aféresis sanguínea, tales como el isolating monocitos para terapias de células dendríticas15,16. En términos de intercambio de búferes, la tecnología CFC sólo se ha aplicado en la fabricación a gran escala17 y todavía no se ha utilizado para la fabricación a menor escala de terapias celulares autólogas.
Para hacer frente a la necesidad de un dispositivo adecuado para la fabricación de células a pequeña escala, se desarrolló recientemente un dispositivo CFC automatizado (Ver Tabla de Materiales),18. El dispositivo automatizado de procesamiento de celdas utiliza la tecnología de centrifugación de contraflujo para eliminar los desechos celulares y facilitar el intercambio de búferes. El dispositivo realiza el intercambio de búferes con un kit de un solo uso que se puede conectar estérilmente a una bolsa de transferencia de celda, lo que permite que las células se procesen dentro de un sistema estéril y cerrado. Aquí, investigamos el uso de un dispositivo centrífugo de contraflujo para realizar el intercambio de búferes en cultivos celulares de mamíferos en protocolos automatizados. En este estudio, probamos el protocolo de intercambio de búferes utilizando células Jurkat y células estromales mesenquimales (MSC) para modelar tipos de células no adherentes y adherentes, respectivamente. Las células de Jurkat son células T inmortalizadas a menudo utilizadas para el estudio de la leucemia aguda de células T19,20. Los MSC son células madre adultas que se han estudiado en ensayos clínicos en humanos para una amplia gama de enfermedades9.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo de intercambio de búfer automatizado descrito es simple y fácil de usar. Sin embargo, hay algunos pasos clave en este protocolo que son críticos y requieren una atención particular. En nuestra experiencia, al procesar celdas más grandes como los MSC (diámetro medio de 10–15 m) cada ejecución debe incluir al menos 1 x 107 celdas para lograr una recuperación celular óptima(Figura 4B). El procesamiento de células más pequeñas, como las cél…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo cuenta con el apoyo del Programa de Apoyo a la Infraestructura Operativa del Gobierno Victoriano y el Bono tecnológico del Gobierno Victoriano proporcionado por el Departamento de Desarrollo Económico, Empleo, Transporte y Recursos. RL es el receptor de una Beca de Desarrollo Profesional del Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica. AL es el ganador de un Premio de Posgrado de Australia.
Materials
| 20 ml Luer lock syringes | BD | 302830 |
| 20% Human serum albumin (HSA) | CSL Behring | AUST R 46283 |
| 4-(Dimethylamino)benzaldehyde | Sigma-Aldrich | 156477-25g |
| 500ml IV saline bag | Fresenius Kabi | K690521 |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240112 |
| Automated cell counter (Countess) | Thermo Fisher Scientific | N/A |
| Cell counting chamber slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 |
| Cell stimulation cocktail (500x) | Thermo Fisher Scientific | 00-4970-93 |
| Cell transfer bags | Terumo | T1BBT060CBB |
| CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G3582 |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R |
| DMEM: F12 media | Thermo Fisher Scientific | 11320082 |
| EnVision plate Reader | Perkin Elmer | N/A |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10099141 |
| Human Interleukin 2 (IL2) Kit | Perkin Elmer | Al221C |
| Luer (female) fittings | CPC | LF41 |
| PC laptop or PC tablet device | ASUS | N/A |
| Plate reader (SpectraMax i3) | Molecular Device | N/A |
| Recombinant Human IFN-γ | PeproTech | 300-02 |
| Rotea counterflow centrifuge cell processing device | Scinogy | N/A |
| Rotea single-use processing kit | Scinogy | N/A |
| RPMI media | Thermo Fisher Scientific | 11875119 |
| Surgical scissors | ProSciTech | 420SS |
| Trichloroacetic acide | Sigma-Aldrich | T6399-250g |
| Trypan Blue stain | Thermo Fisher Scientific | T10282 |
| Trypsin digestion enzyme (TrypLE Express Enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12604013 |
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