قياس الكتلة المتقدريه والاغشيه المحتملة في الخلايا الجذعية التي تكون الدم وخلايا T بواسطة التدفق الخلوي
Summary
هنا نحن وصف طريقه موثوق بها لقياس الكتلة الميتوكوندريا والقدرة الغشاء في الخلايا الجذعية السابقة مثقف الجسم الدم والخلايا T.
Abstract
ان التوازن الدقيق بين السكون والتجديد الذاتي والتمايز هو المفتاح للحفاظ علي الخلايا الجذعية التي تكون الدم (HSC) والحفاظ علي الإنتاج مدي الحياة لجميع خلايا الدماء الناضجة. في السنوات الاخيره ظهرت الأيض الخلوية كمنظم حاسمه من وظيفة HSC ومصير. لقد أظهرنا سابقا ان تعديل الأيض الميتوكوندريا يؤثر مصير HSC. علي وجه التحديد ، من خلال تفكيك كيميائيا سلسله النقل الكترون كنا قادرين علي الحفاظ علي وظيفة HSC في الظروف الثقافية التي تحفز عاده التمايز السريع. ومع ذلك ، الحد من أرقام HSC غالبا ما يمنع استخدام الاختبارات القياسية لقياس الأيض HSC التالي التنبؤ وظيفتها. هنا ، ونحن الإبلاغ عن فحص التدفق الخلوي بسيطه التي تسمح قياس موثوق بها من المحتملة غشاء الميتوكوندريا وكتله الميتوكوندريا في الخلايا النادرة مثل HSCs. نناقش عزل HSCs من نخاع العظم الماوس وقياس الكتلة الميتوكوندريا والغشاء المحتملة آخر الثقافة المجرية السابقة. علي سبيل المثال ، ونحن نظهر تشكيل هذه المعلمات في HSCs عن طريق العلاج مع المغير الأيض. وعلاوة علي ذلك ، ونحن توسيع نطاق تطبيق هذه المنهجية علي الخلايا البشرية المستمدة من الدم الطرفية والأورام اللمفاوية الإنسان التسلل (TILs) ، والتي تبين الاختلافات المثيرة في لمحات الميتوكوندريا ، ربما تعكس الخلية T مختلفه وظيفه. ونحن نعتقد ان هذا الفحص يمكن ان تستخدم في العروض لتحديد مغيري الأيض الميتوكوندريا في أنواع مختلفه من الخلايا في سياقات مختلفه.
Introduction
الخلايا الجذعية للدم (HSCs) هي مجموعه صغيره من الخلايا المقيمة في نخاع العظم لضمان إنتاج الدم والتوازن طوال عمر الكائن الحي. HSCs التوسط في هذه العملية من خلال التخلي عن الأسلاف التي تنتج بدورها عضال متمايزة السلالات خلايا الدم الناضجة عبر عده جولات من انقسام الخلايا والتمايز جيدا مدبره الخطوات1. الأهم من ذلك ، HSCs تنتج طاقتها عبر تحلل لاهوائية. وعلي النقيض من ذلك ، فان المزيد من العاملين الملتزمينوالنشطين المولدينللدم يحولون ايضهم نحو استقلاب الميتوكوندريا 2،3،4. ويعتقد ان هذه الحالة الايضيه متميزة لحماية hscs من الاضرار الخلوية التي تسببها أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) التي تنتجها الميتوكوندريا النشطة, التالي الحفاظ علي المدى الطويل في وظيفة الجسم الحيوي5,6,7,8. القياس المباشر لحاله الأيض HSC هو تحدي والانتاجيه في كثير من الأحيان منخفضه بسبب أرقامها المحدودة. هنا ، ونحن وصف الفحص القائم علي تدفق الخلوية لقياس قويه من المحتملة غشاء الميتوكوندريا (ΔΨm) باستخدام تيتراميثيلرودامين الميثيل استر (TMRM) فلوري ، وكتله الميتوكوندريا باستخدام وصمه الفلورية الخضراء الميتوكوندريا (Mitotracker الأخضر) في HSCs. لقد أظهرنا سابقا ان انخفاض δψm هو علامة وظيفية حسن النية من hscs عاليه النقاء9 والتحوير الأيضي قادره علي خفض δψm تعزيز hscs وظيفة9،10. هنا نقترح استخدام طريقتنا علي التنميط الميتوكوندريا HSCs كاستراتيجية لتحديد جزيئات جديده قادره علي تحسين HSCs ‘ طويلة الأجل أعاده تشكيل الدم المحتملة.
علي سبيل المثال ، ونحن نثبت ان هذا الفحص يقيس بشكل موثوق خفض HSC ΔΨm عند التعرض لفيتامين B3 التناظرية نيكوتيناميد ريبوسيد (NR). وفقا لذلك ، في دراستنا التي نشرت مؤخرا ونحن نثبت ان NR يخفف بقوة الدم الانتعاش بعد الزرع في كل من الماوس وأنظمه الماوس أنسنه بتحسين مباشره الجذعية الدموية ووظائف سلف10. قدره هذه المغيرين الايضيه هي من القيمة السريرية كبيره بالنظر إلى ان معدل الوفاات 25 ٪ يرتبط بتاخير في الدم والتعافي المناعي في المرضي بعد زرع11،12.
وعلاوة علي ذلك ، ونحن نقدم أدله علي ان هذه المنهجية يمكن تطبيقها لتوصيف الشخصية الايضيه ووظيفة خلايا T الإنسان. في السنوات الاخيره ، أصبح تطوير العلاج الخلوي بالتبني (ACT) باستخدام الخلايا الليمفاوية اللمفاوية المتسللة (TILs) النهج الأكثر فعاليه لأنواع معينه من السرطان المتقدم مع التكهن غير المواتية للغاية (علي سبيل المثال ،سرطان الجلد المنتشر ، حيث > 50 ٪ من المرضي يستجيبون للعلاج ومع ذلك ، TILs إيواء ما يكفي من النشاط انتيورم من الصعب توليد14. الانتشار واسعه النطاق والتحفيز ان TILs الخضوع خلال التوسع الجسم السابق يسبب الإرهاق الخلية T والشيخوخة التي تضعف بشكل كبير T استجابه الخلية انتيورم15. الأهم من ذلك ، ترتبط قدره tils ‘ انتيتورال باحكام الأيض16،17 والنهج التي تهدف إلى تعدل الأيض من خلال تثبيط المسار PI3K/akt قد أنتجت نتائج مشجعه18،19. لهذا السبب, نقارن ΔΨm الخلايا T المستمدة من الخلايا أحاديه النواة الدم الطرفية (PBMCs) و TILs المستمدة من المريض, وتبين ان اقل تمايزا المستمدة من PBMCS الخلايا T لديها اقل ΔΨm وكتله الميتوكوندريا بالمقارنة مع TILs عضال متمايزة.
ونحن نتصور ان هذا الفحص يمكن استخدامها لتحديد المغيرين الايضيه الرواية التي تحسن HSC ووظيفة الخلية T عن طريق تشكيل ΔΨm.
Protocol
Representative Results
Discussion
التنظيم المحكم لوظيفة HSC مهم للحفاظ علي الدم مستقره خلال حياه الكائن الحي. مثل مختلف أنواع الخلايا الأخرى في الجسم ، عنصرا رئيسيا يساهم في تنظيم وظيفة HSC هو الأيض الخلوي. الدراسات السابقة من مختبرنا9 وغيرها2,3 وقد تورطت في اهميه الميتوكوندريا في ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر المرفق الأساسي لقياس التدفق الخلوي UNIL علي دعمهم وخاصه الدكتور رومان بيديل. وكان هذا العمل مدعوما بمنحه مؤسسه كريستيان غيرهارد جيسن المقدمة إلى الجمعية التاسيسيه
Materials
| 5 mL FACS tubes | Falcon | 352235 | Sample preparation |
| 96-U bottom plate | Corning | 3799 | Cell culture |
| AutoMACS pro separator | Miltenyi Biotec | Automatic Cell separation | |
| BD FACS AriaIII | Becton and Dickinson | Cell sorting | |
| BD IMag mouse hematopoietic progenitor cell enrichment kit | BD | 558451 | Lineage depletion |
| BD LSRII | Becton and Dickinson | FACS acquisition machine | |
| BD-DIVA | Becton and Dickinson | Acquisition software | |
| CD150 PE | Biolegend | 115904 | Antibody staining mix |
| CD150 PE-Cy5 | Biolegend | 115912 | Antibody staining mix |
| CD48 PB | Biolegend | 103418 | Antibody staining mix |
| Centrifuge- 5810R | Eppendorf | Centrifugation | |
| Ckit PeCy7 | Biolegend | 105814 | Antibody staining mix |
| Flow jo | FlowJo LLC | FACS Analysis software | |
| GraphPad-Prism | GraphPad | Plotting data into graphs | |
| Mitotracker Green | Invitrogen | M7514 | Green-fluorescent mitocondrial stain to measure mitochondrial mass; working concentration = 100 nM; stock concentration = 1 mM |
| Nicotinamide Riboside (NR) | Custom synthesized in house | Metabolic modulator; working concentration = 500 µM; stock concentration = 50 mM | |
| PBS | CHUV | 1000324 | Buffer preparation; working concentration = 1x; stock concentration = 1x |
| Pen-Strep (P/S) | Life technologies | 15140122 | Ex vivo culture; working concentration = 1x; stock concentration = 1x |
| RBC Lysis buffer | Biolegend | 420301 | Lysing Red blood cells; working concentration = 1x; stock concentration = 10x |
| Recombinant Mouse Flt-3 Ligand (FLT3) | RnD | 427-FL-005/CF | Ex vivo culture; working concentration = 2 ng/mL; stock concentration = 10 µg/mL |
| Recombinant mouse stem cell factor (SCF) | RnD | 455-MC-010/CF | Ex vivo culture; working concentration = 100 ng/mL; stock concentration = 50 µg/mL |
| Sca1 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-5981-82 | Antibody staining mix |
| StemlineII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium | SIGMA | S0192 | Ex vivo culture |
| Streptavidin Pac orange | Life Technologies | S32365 | Antibody staining mix |
| Streptavidin Tx red | Life Technologies | S872 | Antibody staining mix |
| TMRM | Invitrogen | T668 | Staining mitochondrial membrane potential; working concentration = 200 nM; stock concentration = 10 mM |
| Ultra pure EDTA | Invitrogen | 15575-038 | Buffer preparation; working concentration = 0.5 M; stock concentration = 1 mM |
References
- Busch, K., et al. Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo. Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).
- Simsek, T., et al. The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche. Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).
- Takubo, K., et al. Regulation of glycolysis by Pdk functions as a metabolic checkpoint for cell cycle quiescence in hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 49-61 (2013).
- Yu, W. M., et al. Metabolic regulation by the mitochondrial phosphatase PTPMT1 is required for hematopoietic stem cell differentiation. Cell Stem Cell. 12 (1), 62-74 (2013).
- Chen, C., et al. TSC-mTOR maintains quiescence and function of hematopoietic stem cells by repressing mitochondrial biogenesis and reactive oxygen species. Journal of Experimental Medicine. 205 (10), 2397-2408 (2008).
- Ito, K., et al. Regulation of oxidative stress by ATM is required for self-renewal of haematopoietic stem cells. Nature. 431 (7011), 997-1002 (2004).
- Ito, K., et al. Reactive oxygen species act through p38 MAPK to limit the lifespan of hematopoietic stem cells. Nature Medicine. 12 (4), 446-451 (2006).
- Tothova, Z., et al. FoxOs are critical mediators of hematopoietic stem cell resistance to physiologic oxidative stress. Cell. 128 (2), 325-339 (2007).
- Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communications. 7, (2016).
- Vannini, N., et al. The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance. Cell Stem Cell. 24 (3), 405 (2019).
- Gratwohl, A., et al. Risk score for outcome after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: a retrospective analysis. Cancer. 115 (20), 4715-4726 (2009).
- Gooley, T. A., et al. Reduced Mortality after Allogeneic Hematopoietic-Cell Transplantation. New England Journal of Medicine. 363 (22), 2091-2101 (2010).
- Rosenberg, S. A., et al. Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T cell transfer immunotherapy. Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).
- Aranda, F., et al. Trial Watch: Adoptive cell transfer for anticancer immunotherapy. Oncoimmunology. 3, 28344 (2014).
- Wherry, E. J. T cell exhaustion. Nature Immunology. 12 (6), 492-499 (2011).
- Ho, P. C., et al. Phosphoenolpyruvate Is a Metabolic Checkpoint of Anti-tumor T Cell Responses. Cell. 162 (6), 1217-1228 (2015).
- Chang, C. H., et al. Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression. Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).
- van der Waart, A. B., et al. Inhibition of Akt signaling promotes the generation of superior tumor-reactive T cells for adoptive immunotherapy. Blood. 124 (23), 3490-3500 (2014).
- Crompton, J. G., et al. Akt inhibition enhances expansion of potent tumor-specific lymphocytes with memory cell characteristics. 癌症研究. 75 (2), 296-305 (2015).
- de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
- Abe, T., et al. Establishment of Conditional Reporter Mouse Lines at ROSA26 Locus For Live Cell Imaging. Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).
- Sukumar, M., et al. Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy. Cell Metabolism. 23 (1), 63-76 (2016).
- Sukumar, M., et al. Inhibiting glycolytic metabolism enhances CD8+ T cell memory and antitumor function. Journal of Clinical Investigation. 123 (10), 4479-4488 (2013).
