Summary
כאן אנו מתארים שיטה אמינה למדוד מסה מיטוכונדריאלי פוטנציאל קרום בתאי גזע vivo המטפאות לשעבר תאים T.
Abstract
איזון נאה של שקט, התחדשות עצמית, ובידול הוא המפתח כדי לשמר את תא גזע המטבית (HSC) הבריכה ולשמור על ייצור לכל החיים של כדוריות הדם הבוגרות. בשנים האחרונות מטבוליזם הסלולר התפתחה כרגולטור המכריע של הפונקציה HSC והגורל. בעבר הדגמנו כי אפנון של מטבוליזם מיטוכונדריאלי השפעות הגורל HSC. באופן ספציפי, על ידי ביטול צימוד כימית שרשרת התחבורה אלקטרון הצלחנו לשמור על תפקוד HSC בתנאי התרבות, כי בדרך כלל לגרום בידול מהיר. עם זאת, הגבלת מספרי hsc לעתים קרובות מונע את השימוש בבחני למדוד את מטבוליזם hsc ולכן לחזות את תפקידם. כאן, אנו מדווחים על שיטת זרימה פשוטה cy, המאפשרת מדידה אמינה של פוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי מסה מיטוכונדריאלי בתאים נדירים כגון HSCs. אנו דנים בבידוד של HSCs מתוך מח עצם העכבר ומדידה של מסה מיטוכונדריאלי, ממברנה פוטנציאל הפוסט לשעבר vivo התרבות. כדוגמה, אנו מציגים את האפנון של פרמטרים אלה ב HSCs באמצעות טיפול עם מאפנן מטבולית. יתר על כן, אנו להאריך את היישום של מתודולוגיה זו על הגוף האנושי הנגזר דם בתאי T ואת הגידול האנושי החדירה לימפוציטים (TILs), מראה הבדלים דרמטיים פרופילים מיטוכונדריאלי שלהם, אולי המשקף תא T שונים פונקציונליות. אנו מאמינים שניתן ליישם את האפשרות הזאת בהקרנות כדי לזהות מודולטורים של חילוף חומרים מיטוכונדריאלי בסוגי תאים שונים בהקשרים שונים.
Introduction
תאי גזע המטפאות (HSCs) הם אוכלוסייה קטנה של תאים המתגוררים במח העצם להבטיח ייצור דם הומאוסטזיס במהלך חייו של אורגניזם. HSCs מתווך תהליך זה על ידי מתן ושלתי כי בתורו לייצר סופני הבדיל תאי דם בוגרים באמצעות מספר סיבובים של החטיבה התא ו מאורגן היטב שלבים1. חשוב מכך, HSCs לייצר את האנרגיה שלהם באמצעות גליקוליזיס אנאירובית. לעומת זאת, מחויבים יותר פעיל המטפאות ושלתי להחליף את חילוף החומרים שלהם לכיוון חילוף החומרים מיטוכונדריאלי2,3,4. מצב זה מטבולית ברורים הוא האמין להגן על HSCs מפני נזק הסלולר שנגרמו על ידי מינים חמצן תגובתי (ROS) המיוצר על ידי active מיטוa, ובכך שמירה על הטווח הארוך שלהם בפונקציה vivo5,6,7,8. מדידה ישירה של מצב מטבולית HSC היא מאתגרת ולעתים קרובות תפוקה נמוכה בשל המספרים המוגבלים שלהם. כאן, אנו מתארים שיטת הזרימה cy, מבוסס על מדידה חזקה של פוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי (ΔΨm) באמצעות מתיל הטטרמתיל (TMRM) ניאון, ומסה מיטוכונדריאלי באמצעות כתם ירוק מיטוכונדריאלי ירוקה (Mitotracker גרין) ב HSCs. הדגמנו בעבר כי נמוך ΔΨm הוא סמן פונקציונלי בתום-בלבד של מטוהרים מאוד HSCs9 ו מודולים מטבולית מסוגל להוריד ΔΨm לשפר HSCs פונקציה9,10. כאן אנו מציעים להשתמש בשיטה שלנו על HSCs פרופיל מיטוכונדריאלי כמו אסטרטגיה כדי לזהות מולקולות הרומן מסוגל לשפר את הפוטנציאל לטווח ארוך של HSCs דם מחדש.
לדוגמה, אנו מדגימים כי האפשרות הזו מודדת באופן אמין את הורדת HSC ΔΨm בעת החשיפה לויטמין B3 באמצעות הריבוסייד (NR). לפיכך, במחקר שפורסם לאחרונה שלנו אנו מדגימים כי ע"נ בחוזקה התאוששות ההתאוששות דם בשני העכבר ההומניסטיים מערכות העכבר על ידי שיפור ישיר גזע המטתית ופונקציות מחולל הקדמון10. הקיבולת של מודולטורים כגון זה הוא בעל ערך קליני גדול בהתחשב בכך 25% שיעור התמותה מקושר לעיכוב בדם והתאוששות החיסונית בחולים מושתלים11,12.
יתר על כן, אנו מספקים ראיות כי מתודולוגיה זו ניתן להחיל על האפיון של פרופיל חילוף החומרים ותפקוד של תאי T האדם. בשנים האחרונות, התפתחות של טיפול בתאים המאמצת (ACT) באמצעות גידול אוטוולוגי החדירה לימפוציטים (TILs) הפך את הגישה היעילה ביותר עבור סוגים מסוימים של סרטן מתקדם עם פרוגנוזה שלילי מאוד (למשל, מלנומה גרורתית, שם > 50% של חולים להגיב לטיפול עד 24% מהחולים יש רגרסיה מלאה)13 עם זאת, TILs מחסה פעילות אנטי סרטניים מספיק קשה ליצור14. התפשטות נרחבת וגירוי כי TILs לעבור במהלך הרחבת לשעבר vivo לגרום לתשישות תא T והזדקנות כי לפגוע באופן דרמטי התגובה תא אנטי הגידול15. חשוב מכך, הקיבולת האנטי מוסרית TILs מקושרת הדוק לחילוף החומרים שלהם16,17 וגישות שמטרתן לווסת את חילוף החומרים באמצעות עיכוב של מסלול PI3K/akt הפיק לעודד תוצאות18,19. מסיבה זו, אנו משווים את ΔΨm של תאים שמקורם בתאי דם היקפיים מוניונקה (PBMCs) ואת החולה נגזר TILs, ולהראות כי הבדיל פחות PBMC-נגזר בתאי T יש ΔΨm נמוך יותר מסה מיטוכונדריאלי לעומת TILs הבדיל סופני.
אנו מסוגלים לדמיין שניתן להשתמש בתיקון זה כדי לזהות מאפטורים מטבולית חדשניים המשפרים את פונקציית התאים HSC ו-T באמצעות האפנון של ΔΨm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים המתוארים בכתב היד מתבצעים לפי ההנחיות של המוסד שלנו ובוצעו בהתאם לחוק השוויצרי לניסויים בבעלי חיים (אישור: VD3194) ולמחקר הכרוך בדגימות אנושיות (פרוטוקול: 235/14; מלצר 2017-00490)
1. שליפת תאי גזע
- לרכוש פראי סוג C57BL6/J עכברים ולשמור אותם בבית בעלי חיים לפחות שבוע כדי להפחית את התחבורה הקשורים למתח.
- ביום הניסוי, המתת החסד את העכבר באמצעות שיתוף2 חנק.
- רסס את העכבר עם 70% אתנול כדי לחטא את הפרווה ולחתוך לפתוח את העכבר על הבטן באמצעות כלים כירורגי רגיל, כגון מספריים לחיתוך מלקחיים, כדי לחתוך את עצם הירך ואת עצמות השוקה מן הרגליים האחוריות.
- הסר את השרירים המחוברים לעצם הירך, השוקה, ואת האגן באמצעות מגבת נייר רכה ומניחים את העצמות הנקיות בצינור 50 mL המכיל PBS עם 1 מ"מ EDTA (מאגר) על הקרח.
- רסס מרגמה ומכתש עם 70% אתנול ומניחים אותו במכסה של תרבות התא. לעקר אותו עם UV במשך 30 דקות. פוסט עיקור לשטוף את המרגמה ואת הפילינג עם מאגר כדי להסיר עקבות של אתנול.
- שים את העצמות הנקיות עם מאגר מסוים (~ 10 מ"ל) בחומר המליטה ולמחוץ אותם בעדינות כדי לקבל את מח העצם בהשעיה. עכשיו, לאסוף את ההשעיה התא ולהעביר אותו דרך מסננת תא 70 יקרומטר לתוך שפופרת 50 mL כדי לקבל השעיה תא יחיד.
- חזור על שלב 1.6 עד שכל מח העצם הופק ושברי העצם הפך לבן.
- מניחים את שפופרת 50 mL (s) המכיל את מח העצם השעיה תא יחיד על צנטריפוגה. הפעל את הצנטריפוגה ב 300 x g עבור 10 דקות ב 4 ° צ' כדי לעבור את התאים.
- בינתיים, להכין 10 מ ל של מאגר הליזה 1x RBC במים מזוקקים אוטוקלאויים. סנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.22 יקרומטר.
- לאסוף את השפופרת לדוגמה מתוך הצנטריפוגה ו לדקנט supernatant. פיפטה מאגר הליזה 1 x RBC (טבלת חומרים) על הגלולה תא. להוציא את הגלולה ולהכין פתרון הומוגנית על ידי מלטף למעלה ולמטה כמה פעמים. אפשר לצינור להיות בטמפרטורת החדר במשך 1 – 2 דקות להתרחשות הליזה RBC. להפסיק את תהליך הפירוק על ידי מילוי הצינור עם המאגר.
- מניחים את הצינור על צנטריפוגה ו ספין ב 300 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. לאסוף את הצינור מהצנטריפוגה ולקחת את הסופרנטאנט. השהה מחדש את הגלולה על ידי הוספת 10 מ ל של מאגר ולסנן את הפתרון לתוך צינור חדש 50 mL באמצעות מסננת תא 70 יקרומטר כדי להסיר את הפסולת בשל הליזה rbc.
- צנטריפוגה את הצינור ב 300 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. לאסוף את הצינור מהצנטריפוגה ולקחת את הסופרנטאנט. השהה מחדש את הגלולה ב-500 μL של מאגר.
- הסר מ100 μl סדרת מחלקים ושמור בשפופרת נפרדת של 1.5 mL. הוסף 50 μl של שושלת היוחסין של ביוטין מפחית את קוקטייל הנוגדן מערכת העשרה הקדמון (טבלת חומרים) עד הנותרים 450 μl של השעיית תא. דגירה ב 4 ° c על שייקר עבור 15 דקות.
- הוסף 15 מ ל של מאגר וצנטריפוגה את הצינור ב 300 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. לאסוף את הצינור מהצנטריפוגה ולקחת את הסופרנטאנט. השהה מחדש את הגלולה ב-460 μL של מאגר. להסיר 10 μl סדרת מחלקים ולשמור בצינור 1.5 mL נפרד.
- הוסף 50 μL של חרוזים streptavidin מגנטיים מערכת העשרה מחולל הקדמון (טבלת חומרים), אל ההשעיה הנותרים 450 התאים μl. דגירה ב 4 ° c על שייקר עבור 15 דקות.
- הוסף 15 מ ל של מאגר וצנטריפוגה את הצינור ב 300 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. לאסוף את הצינור מהצנטריפוגה ולקחת את הסופרנטאנט. השהה מחדש את הגלולה ב-5 מ ל של מאגר והעבר את הפתרון לשפופרת של 15 מ ל.
- קח את השפופרת למפריד תאים אוטומטי (טבלה של חומרים). הפעל תוכנית כביסה לשטוף הראש אבובים של מפריד התא. מניחים את המדגם ושני שפופרות אוסף על מחזיק הצינור. בצע הפרדה באמצעות התוכנית "לרוקן". אסוף את השברים החיוביים והשליליים ממפריד התאים האוטומטי לאחר שהריצה הסתיימה.
הערה: בהעדר מפריד תאים אוטומטי, המשתמשים יכולים להשתמש בטורים מגנטיים ידניים ומגנטים תואמים, לפי המדריך למשתמש. על המשתמשים לזכור שתהליך ההפרדה הידנית איטי יותר מהאוטומטי. כמו כן, העמודות הידניות מועדים יותר לסתימת. לכן, מומלץ למשתמשים לדלל את המדגם ולטעון אותו באיטיות. - למחוק את השבר החיובי. מלא את צינור השבר השלילי במאגר. צנטריפוגה את הצינור ב 300 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.
- בינתיים, להכין את שילוב הנוגדן ב 1 מ ל של פתרון הנפח הסופי ואת הפקדים צבע יחיד ב 200 μL של פתרון הנפח הסופי כפי שמתואר בטבלה של חומרים ושולחן 1.
הערה: אם TMRM ואת הכתם הירוק מיטוכונדריאלי ירוקה הם להיות משולבים עם כתמי סמן תא גזע, לאחר מכן להחליף CD150-PE עם CD150-PEcy5 ו Streptavidin-Tx אדום עם Streptavidin-Pac תפוז. - לאסוף את השפופרת לדוגמה מתוך הצנטריפוגה ו לדקנט supernatant. השהה מחדש את הגלולה ב 1 mL של תערובת נוגדנים. הוסף 10 μL של תאים (משלב 1.13) בכל אחד מצינורות הבקרה של צבע אחד (למעט שושלת יוחסין). הוסף 10 μL של תאים (משלב 1.14) בצינור היוחסין בצבע יחיד.
- מודטה את המדגם ואת צינורות בקרת צבע יחיד ב 4 ° c על שייקר עבור 45 דקות. לכסות את דלי קרח עם מכסה או רדיד אלומיניום.
- למלא את כל הצינורות עם מאגר צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. בטל את הסופרנטאנט והשהה מחדש את המדגם באחד מ-mL של פקדי מאגר וצבע יחיד ב-200 μL של מאגר.
- העבר את המדגם ואת בקרי הצבע הבודד ל-5 מ ל מסנני מסנן של FACS.
- קח את הצינורות אל מכונת מיון ולמיין את אוכלוסיית HSC (לעבור אסטרטגיה באיור 1א) בצינורות 1.5 ML המכילים 400 μl של תא גזע הרחבת בינונית.
2. לשעבר התרבות הVivo של תאי גזע המטבטיים
- לאסוף צינורות המכילים תאים ממוינים (ראה סעיף 1 להפקת התא). צנטריפוגה את הצינורות ב 300 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. הסירו בעדינות את רוב הסופרנטנט מבלי להסיר את הגלולה ולהשאיר 50 – 80 μL על גבי הגלולה התא. פעולה זו מצמצמת את אובדן התאים.
- להשעות מחדש את הגלולה התא בינונית הרחבת תא גזע לכרך הסופי תלוי במספר התנאים להיבדק (לספור עבור 100 μL לכל טוב/מצב של תרבות).
- הכנת מדיום התרבות 2x המכיל בינונית הרחבת תא גזע, מקדם תא גזע (200 ng/ml), FLT3 ליגנד (4 ng/ml) ואנטיביוטיקה עט-דלקת (1%) (2x בינונית בסיס; טבלה של חומרים).
- קח תרבות רקמה סטרילית שטופלו 96 U-תחתון צלחת הבאר (טבלת חומרים) ולזהות את הבארות שבו התאים יהיו תרבותיים (עיצוב צלחת באיור 1B).
הערה: מומלץ למשתמשים להימנע מבארות שוליים, שכן הם רגישים יותר לאידוי. - שים 100 μL של בינוני 2x בסיס שהוכן בעבר בשלב 2.3 בבארות אלה. ב-NR מסומן היטב להוסיף 2 μL של פתרון 100 x NR (טבלת חומרים). . לחדש את נאט ו כל 24 שעות
הערה: חידוש מלאי הוא ספציפי ל-NR. מאפטורים מטבוליים אחרים עשויים או אינם זקוקים לחידוש מלאי. - זרעי 100 μL של תאים שהוכנו בשלב 2.2 על גבי הבארות המכילות מדיום בסיס 2x. בניסוי זה מספר HSCs הזרע לבאר היו בין 800 – 1000 תאים.
- הכינו חמש בארות נוספות המכילות מדיום בסיס 2x. בכל אחד מאלה להוסיף 100,000 מלאה במח העצם תאים (משלב 1.13) מושעה ב 100 μL של הרחבת תא גזע בינונית לשמש לצביעת פקדים עבור הודעה לאחר זרימת התרבות הניתוח cy, לנסות.
הערה: אם משתמשים רוצים לשלב סמנים תא גזע סמנים מיטוכונדריאלי עבור ניתוח תרבות פוסט מומלץ למיין בנוסף את אוכלוסיית הקדמון (או תאי Ckit או תאים LKSCD150-תאים). זרעים אלה מיון ושלתי בבארות בקרת הצביעת עבור הצבת התרבות זרימת cy try ניתוח. להכין אחד טוב לכל צבע הכתם. - שים 200 μL של מים אוטוקלשים בכל הבארות שמסביב כדי להפחית אידוי מבארות המכילות תאים. השאירו את הצלחת מופרעת בחממה ב 37 ° צ' ו 5% CO2 למשך תקופת התרבות (72 h). הסר את הצלחת לחדש את ה-NR כל 24 שעות ולמקם אותו בחממה.
3. מדידה של מסה מיטוכונדריאלי ופוטנציאל ממברנה
- בסוף תקופת התרבות להכין פתרון 100x של TMRM (20 μM) ו Mitotracker ירוק (10 μM) (כתם פלורסנט ירוק) בינונית תא גזעהרחבה (טבלת חומרים).
- הוסף 2 μL של פתרון TMRM של 100x ו-2 μL של פתרון צבע פלורסנט ירוק באורך 100x בכל אחת מבארות הבדיקה. הוסף 2 μL של 100x TMRM בבקרת TMRM היטב. הוסף 2 μL של כתם פלורסנט ירוק 100x בבקרת Mitotracker היטב. מניחים את הצלחת חזרה בחממה ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 45 דקות לכסות את החלק העליון של הצלחת עם רדיד אלומיניום.
הערה: שליטה נוספת עם Verapamil (מעכבי משאבת ABC) יכול להיות מוכן אם ABC משאבת מתווכת לצבוע מתווך צריך להיבדק. בשביל זה, להוסיף 50 μM Verapamil באחת הבארות הבדיקה 1 h לפני הכתמים עבור TMRM וצבע פלורסנט ירוק. - להסיר את הצלחת מן החממה ו צנטריפוגה אותו ב 300 x g עבור 5 דקות. להפוך את הצלחת כדי להסיר את supernatant. הוסף 200 μL של מאגר FACS סטנדרטי (PBS-1 מ"מ EDTA-P/S-2% FBS), צנטריפוגה את הצלחת ב 300 x g עבור 5 דקות.. הסר את הסופרנטאנט חזור על שטיפת השלב הזה 3 x. על המשתמשים לוודא שלוחית הצלחת תמיד מכוסה בנייר כסף, כדי לספק חשיפה מינימלית לאור ישיר.
הערה: אם משתמשים צריכים לשלב את הכתמים מיטוכונדריאלי עם כתמים תא גזע, המדגם יצטרך להיות מודקרת עם שילוב נוגדן של כל סמני תא גזע ושולטת צבע יחיד יהיה צורך להיות מוכתם עם נוגדנים בודדים בנפרד על 4 ° צ' עבור 30 – 45 דקות.
הערה: בכל השלבים משתמשים חייבים לשמור על הצלחת מכוסה רדיד אלומיניום. על המשתמשים לשים לב שצעד מכתים נוסף זה ושלבי הכביסה הבאים עלולים לגרום לאבדן תאים נוסף. - השהה מחדש את התאים ב-200 μL של מאגר FACS והעבר לצינורות של FACS.
- הפעל את הדגימות על הזרם cytometer (ראה איור 1). צינורות צבע יחיד המכילים WBM כוללים: (1) ללא ויטראז; (2) ממשק DAPI; (3) TMRM (PE); (4) צבע פלורסנט ירוק (FITC); (5) מלוא הכתמים (PE ו-FITC).
- ראשית רכוש את פקדי הצבע היחיד כדי להגדיר את המחשב. השתמש בתוכנה הפועלת במחשב כדי לחשב את הפיצוי. לאחר החלת פיצוי, לרכוש את הדוגמה HSC ולהקליט כמה שיותר אירועים.
הערה: אם תא הגזע ואת סמנים מיטוכונדריאלי משולבים, המשתמשים צריכים להיות זהירים במיוחד עם פיצוי בין TMRM (PE), CD150 (PE-Cy5), ו-סקה-1 (APC). כמו כן, יש להפעיל את הדגימות מיד לאחר הצביעת. - יצא את קבצי ה-FACS מהציטומטר ונתח את הנתונים בתוכנת ניתוח (טבלת חומרים).
- לניתוח, פתח את הקובץ בתוכנת הניתוח. השימוש ב-FSC-A ו-אס. אס. מזהה את אוכלוסיית התאים. זיהוי הזינגטים בשערים הבאים לפני התוויית השבר השלילי של DAPI (תאים חיים). בשער התאים החיים להפוך את העלילה מתאר ב TMRM וירוק הכתם בערוץ פלורסנט למדוד ΔΨm ו מסה, בהתאמה (איור 2א). לייצא את עוצמת הזריחה הממוצע (MFI) של שני ערוצים אלה בשער התא החי.
- השער הנמוך של TMRM מוגדר בהתבסס על אוכלוסיית הכתפיים בערוץ TMRM. ניתן להשתמש בפקד הצבע היחיד של TMRM כדי לזהות אוכלוסיית כתף זו כדי להגדיר את השער. לייצא את הפרופורציה של החיים של תאים בשער הנמוך TMRM בשליטתך ולבדוק דגימות עבור התוויית המידע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באיור 1 , אנו מראים את אסטרטגיית הפריסה לבידוד של תאי גזע המטבטיים מתוך מח עצם העכבר והפריסה של הצלחת עבור תרבות vivo ex שלהם. איור 1A מראה את הזיהוי של שבר לימפוציט ב-אס. אס. אס/fsc-מזימה. כאשר הוסרו ממנו בשער הזינגטים ולאחריו זיהוי תאים חיים על-ידי היעדר אות DAPI. אוכלוסיית LKS, המוגדרת על ידי שושלת היוחסין-Sca1+ckit+, זוהתה. אוכלוסייה זו ידועה כמכילה תאים גזע ומחולל קדמון. HSCs טופס סביב 5 – 10% התאים באוכלוסייה LKS וזוהו על ידי הCD150+CD48- אוכלוסיה. איור 1ב מייצג את הפריסה של הצלחת 96-באר לתרבות vivo ex. מיון HSCs היו מצופים בתנאי תרבות שונים: במקרה זה, שליטה ו-NR בתנאים התרבותיים שנוספו. כל תאי מח העצם מצופים גם כפקדי צבע יחיד כמתואר בפרוטוקול. חשוב למלא את כל הבארות שמסביב עם מים כדי למנוע התאיידות של התקשורת מבארות המכילות תאים. יתר על כן, כפי שהוזכר קודם לכן, בארות שוליים נמנעו מתרבות התא כי הם רגישים יותר לאידוי.
איור 2 מראה את המדידה של פוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי (ΔΨm) ו המסה בתרבות HSCs post. איור 2מראה חלקות המייצג של רמות tmrm (מעל) וירוק מיטוכונדריאלי ירוקה כתם (למטה) ב HSCs תרבותי בשליטה ו-NR בתנאים שיושלם. הטיפול ב-NR הראה עלייה ברורה באוכלוסיההנמוכה של tmrm. איור 2ב מראה את הקוונפיקציה משלוש דגימות עצמאיות. הטיפול ב-NR הגדיל באופן משמעותי את שיעור התאים בשערהנמוך של tmrm והראה הפחתת משמעותית של עוצמת הקרינה של tmrm. מסה מיטוכונדריאלי (המיוצגת בעוצמה ירוקה-פלואורסצנטית) לא השתנה על-ידי התוספת של נאט"ו. בנוסף, אנו משולבים סמן תא גזע הכתים עם התרבות הפוסט מיטוכונדריאלי לכתוב. איור 2ג מציג את אסטרטגיית ה-HSCs לזיהוי התרבות השלילית של אוכלוסיות שליליות ו-lks בשני התנאים התרבותיים. TMRM וירוק מיטוכונדריאלי ירוקה הפרופיל כתם של אלה מגודרת HSCs נראה באיור 2ד. החשיפה ל-NR הראתה עלייה משמעותית באוכלוסיההנמוכה של% tmrm וירידה משמעותית בעוצמת הקרינה הפלואורסצנטית של tmrm ב-HSCs הסגורה. מיטוכונדריאלי ירוק כתמים האות הירוק נשאר ללא שינוי בשני התנאים.
איור 3 מראה את המדידה של פוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי (ΔΨm) ו המסה בתאי T שונים: דם היקפיים תאים מונמונומנט ברור (PBMCs) CD4+ ו CD8+ T תאים, כמו גם CD4+ ו CD8+ הגידול לימפוציטים החדירה (TILS) לאחר פרוטוקול ההרחבה המהירה (נציג). איור 3מראה מתווה המייצג של רמות tmrm (לעיל) וירוק-פלורסנט רמות הכתמים הירוקים (למטה) של במחזור (pbmc) והחדירה הגידול (TIL) CD4+ ו CD8+ T תאים. TILs הראה עלייה ברורה TMRM ו מיטוכונדריאלי ירוק פלורסנט אות כתמים לעומת מחזורי תאי T. איור 3ב מראה את כימות MFI של tmrm וכתמים מיטוכונדריאלי ירוק פלורסנט. TILs מוצג גבוה יותר TMRM ו מיטוכונדריאלי ירוק פלורסנט לצביעת אותות לעומת תאים PBMC-נגזר T. נתונים אלה מצביעים על כך TILs יש פרופיל מטבולית מכובד עם מוגברת ΔΨm ו מיטוכונדריאלי המסה.
איור 1: בידוד והתרבות של תאי גזע המטבטיים. (א) מ, אסטרטגיה לבידוד של תאי גזע המטבטיים (HSCs) המבוססים על סמני שטח התא. HSCs זוהו כשושלת היוחסין-Sca1+ ckit+ (lks) CD150+CD48-. (ב) עיצוב של 96 צלחת היטב לשים בתרבות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: פרופילים מיטוכונדריאלי של HSCs. (א) facs העלילה מתאר מראה HSCs הודעה התרבות ב בסיס או NR התנאים שיושלם. TMRM (לעיל) וכתמים ירוקים מיטוכונדריאלי ירוק (Mitotracker) (להלן) פרופילים מוצגים. (ב) כימות של tmrm ומיטוכונדריאלי ירוק פלורסנט סימן כתמים. התוספת של ה-NR הביאה לירידה בפרופיל TMRM תוך שמירה על אות הכתמים הירוקים הפלואורסצנטי הירוק. (ג) מתווה מתאר המציג זיהוי של אוכלוסיית hsc בשליטה ו-NR שנוספו להציב את התרבות הפוסט. (ד) מתווה מתאר וכימות tmrm ו מיטוכונדריאלי ירוק פלורסנט האות כתם בתרבות HSCs post פנוטי. תוספי NR הפחיתו את האות TMRM בעוד האות הירוק מיטוכונדריאלי בצבע הפלורסנט נשאר ללא שינוי ב HSCs. סטודנט t * * *p < 0.001, * * p < 0.01, * p < 0.05, לא משמעותי > 0.05, בסרגלי שגיאות = SEM. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: פרופילים מיטוכונדריאלי של האדם pbmcs ו TILs: (א) facsמתארהעלילה מראה CD4+ ו CD8+ טרי מבודדים PBMCS או גידול-נגזר CD4+ ו CD8+ post נציג (פרוטוקול הרחבה מהירה). TMRM (לעיל) וכתמים ירוקים מיטוכונדריאלי ירוק (Mitotracker) (להלן) פרופילים מוצגים. (ב) כימות של tmrm ומיטוכונדריאלי ירוק פלורסנט סימן כתמים. TILs הציג פעילות מיטוכונדריאלי נמוכה יותר ומסה. סטודנט t-test * * *p < 0.001, * *p < 0.01, *p < 0.05, לא משמעותי > 0.05, בסרגלי שגיאות = SD. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| S.No | שם נוגדן | דילול העבודה |
| 1 | Streptavidin Tx אדום | 1/200 |
| 2 | Sca1 נגמ ש | 1/200 |
| 3 | PeCy7 ckit | 1/100 |
| 4 | CD150 PE | 1/100 |
| מיכל 5 | CD48 PB | 1/100 |
| לשמש רק אם תא גזע וסמנים מיטוכונדריאלי בשילוב. | ||
| 6 | Streptavidin Pac כתום | 1/200 |
| 7 | CD150 PE-Cy5 | 1/100 |
שולחן 1: מדלל נוגדנים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
התקנה הדוקה של הפונקציה HSC חשוב לשמור על המטפיאה יציבה במהלך חייו של אורגניזם. כמו סוגים שונים של תאים אחרים בגוף, רכיב מפתח שתורם לוויסות הפונקציה HSC הוא חילוף החומרים הסלולר. מחקרים קודמים מהמעבדה שלנו9 ואחרים 2,3 יש מעורבים את החשיבות שלהמיטומטרבשמירה על מצב מטבולי ברורים HSCs. בשל מספר נמוך מאוד של HSCs מבודד מח עצם murine, קשה לנתח אותם באמצעות בחני מטבולית סטנדרטית (למשל, צריכת חמצן עם סוסון ים). בהתבסס על העבודה הקודמת שלנו, אנו מתוקננת מתקן פשוט cy, לנסות הזרימה למדוד באופן אמין מסה מיטוכונדריאלי פוטנציאל ממברנה (בדיקה עקיפה לפעילות) במספר נמוך של תאים (כלומר, HSCs). השאלה הזאת מאפשרת מדידה על תאים חיים מבלי להתפשר על הכדאיות שלהם9, מה שהופך אותם זמינים עבור כל הזרם התפקודי במורד (כגון השתלת מח עצם) שמשתמשים עשויים לרצות לבצע. אנו לחזות את היכולת להיות מועסק בניסויים הקרנת, המאפשר בדיקה מהירה על פרופיל מיטוכונדריאלי של HSCs מרקעים גנטיים שונים או מודלים הסתרה. חשוב מכך, שיטת הבדיקה שלנו יכולה להיות משולבת עם כתמים cfse כדי לקבל בדיקה כפולה על התפשטות hsc ואת פרופיל מיטוכונדריאלי9,10, המאפשר ניתוח של גורל מטבולית של חלוקת HSCs. בהתחשב בכך שזה הליך מכתים קשה ואנחנו עובדים עם מספר נמוך של תאים (HSCs), חשוב לפרסם צנטריפוגה המשתמשים תמיד לעזוב 80 – 100 μl של פתרון בצינורות על מנת למזער את אובדן התאים. בנוסף, במהלך כל השלבים לכתוב מכתים את הצינורות או לוחות צריך להיות מוגן מפני אור, או על ידי כיסוי אותם נייר כסף או עבודה בסביבה אור נמוכה. אם המשתמשים מחליטים לשלב את הכתם HSC עם צבעים מיטוכונדריאלי הם חייבים לבדוק אם הפיצוי מבוצע כראוי, במיוחד בין TMRM (PE), PeCy5 ו APC.
חשוב מכך, פרסום לאחרונה שאלות על השימוש בצבעים מיטוכונדריאלי ב HSCs כי הם עלולים להיות רגישים משאבה. מחקרים אלה מדווחים כי התאים הפרימיטיבים הפרימיטיביים ביותר יש מספר גבוה יותר של המיטוסטיים לעומת ושלתי20מחויבים שלהם. בניסיון שלנו, השימוש של מודלים גנטיים של העכבר (mito eGFP עכברים21), המיטומטר לצבוע שיטות מכתים (נוגדן TOM20), ניתוח qpcr תומך ברעיון כי ברוב התאים הפרימיטיביים ביותר המטבטיים יש תוכן מיטוכונדריאלי נמוך10. אנו מאמינים כי יש לבצע מחקרים נוספים כדי להבהיר את הפער הזה בשטח.
במקביל, אנו מדגימים כי השימוש בפרופיל מיטוכונדריאלי יכול להיות מנוצל כדי לקבוע את הכושר המטבולית של האדם TILs ולפתח אסטרטגיות מטבולית שמטרתה לשחזר את הפונקציה של תאי T מותש. למעשה, תאים T מבודדים PBMCs להציג פעילות מיטוכונדריאלי נמוך (TMRM) ו המסה (Mitotracker גרין), בעוד תאי T מותשים יותר כגון TILs יש פעילות מיטוכונדריאלי גבוה יותר מסה, מציע תכנות מטבולית אפשרי המתרחשים במהלך התשישות. בהתאם, מחקרים שפורסמו לעיל הוכיחו כי תא גזע כמו זיכרון T תאים (tscm), תאים T עם התמדה משופרת מסוגל לטווח ארוך התגובה להיזכר, יש ΔΨm נמוך וטיפולים מיקוד מטבוליזם התא T יכול להשפיע באופן מוגבר על תפקידם22,23.
בסופו של דבר, אנו מאמינים כי הגישה שלנו יכול להיות כלי רב ערך לזיהוי תרכובות הרומן שיכול לתקן תפקוד HSCs (g., הזדקנות או ממאירות המטולוגית) על ידי שחזור כושר מיטוכונדריאלי שלהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
חלק מהרכיבים של עבודה זו הוגשו כיישום P1828EP00 למשרד הפטנטים האירופי.
Acknowledgments
אנו מודים לזרם UNIL Flow מתקן ליבה על תמיכתם במיוחד ד ר רומן Bedel. עבודה זו נתמכת על-ידי מלגת הקרן של כריסטיאן גרהרד בגין נ. ב. וO.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mL FACS tubes | Falcon | 352235 | Sample preparation |
| 96-U bottom plate | Corning | 3799 | Cell culture |
| AutoMACS pro separator | Miltenyi Biotec | Automatic Cell separation | |
| BD FACS AriaIII | Becton and Dickinson | Cell sorting | |
| BD IMag mouse hematopoietic progenitor cell enrichment kit | BD | 558451 | Lineage depletion |
| BD LSRII | Becton and Dickinson | FACS acquisition machine | |
| BD-DIVA | Becton and Dickinson | Acquisition software | |
| CD150 PE | Biolegend | 115904 | Antibody staining mix |
| CD150 PE-Cy5 | Biolegend | 115912 | Antibody staining mix |
| CD48 PB | Biolegend | 103418 | Antibody staining mix |
| Centrifuge- 5810R | Eppendorf | Centrifugation | |
| Ckit PeCy7 | Biolegend | 105814 | Antibody staining mix |
| Flow jo | FlowJo LLC | FACS Analysis software | |
| GraphPad-Prism | GraphPad | Plotting data into graphs | |
| Mitotracker Green | Invitrogen | M7514 | Green-fluorescent mitocondrial stain to measure mitochondrial mass; working concentration = 100 nM; stock concentration = 1 mM |
| Nicotinamide Riboside (NR) | Custom synthesized in house | Metabolic modulator; working concentration = 500 µM; stock concentration = 50 mM | |
| PBS | CHUV | 1000324 | Buffer preparation; working concentration = 1x; stock concentration = 1x |
| Pen-Strep (P/S) | Life technologies | 15140122 | Ex vivo culture; working concentration = 1x; stock concentration = 1x |
| RBC Lysis buffer | Biolegend | 420301 | Lysing Red blood cells; working concentration = 1x; stock concentration = 10x |
| Recombinant Mouse Flt-3 Ligand (FLT3) | RnD | 427-FL-005/CF | Ex vivo culture; working concentration = 2 ng/mL; stock concentration = 10 µg/mL |
| Recombinant mouse stem cell factor (SCF) | RnD | 455-MC-010/CF | Ex vivo culture; working concentration = 100 ng/mL; stock concentration = 50 µg/mL |
| Sca1 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-5981-82 | Antibody staining mix |
| StemlineII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium | SIGMA | S0192 | Ex vivo culture |
| Streptavidin Pac orange | Life Technologies | S32365 | Antibody staining mix |
| Streptavidin Tx red | Life Technologies | S872 | Antibody staining mix |
| TMRM | Invitrogen | T668 | Staining mitochondrial membrane potential; working concentration = 200 nM; stock concentration = 10 mM |
| Ultra pure EDTA | Invitrogen | 15575-038 | Buffer preparation; working concentration = 0.5 M; stock concentration = 1 mM |
References
- Busch, K., et al. Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo. Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).
- Simsek, T., et al. The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche. Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).
- Takubo, K., et al. Regulation of glycolysis by Pdk functions as a metabolic checkpoint for cell cycle quiescence in hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 49-61 (2013).
- Yu, W. M., et al. Metabolic regulation by the mitochondrial phosphatase PTPMT1 is required for hematopoietic stem cell differentiation. Cell Stem Cell. 12 (1), 62-74 (2013).
- Chen, C., et al. TSC-mTOR maintains quiescence and function of hematopoietic stem cells by repressing mitochondrial biogenesis and reactive oxygen species. Journal of Experimental Medicine. 205 (10), 2397-2408 (2008).
- Ito, K., et al. Regulation of oxidative stress by ATM is required for self-renewal of haematopoietic stem cells. Nature. 431 (7011), 997-1002 (2004).
- Ito, K., et al. Reactive oxygen species act through p38 MAPK to limit the lifespan of hematopoietic stem cells. Nature Medicine. 12 (4), 446-451 (2006).
- Tothova, Z., et al. FoxOs are critical mediators of hematopoietic stem cell resistance to physiologic oxidative stress. Cell. 128 (2), 325-339 (2007).
- Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communications. 7, (2016).
- Vannini, N., et al. The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance. Cell Stem Cell. 24 (3), 405 (2019).
- Gratwohl, A., et al. Risk score for outcome after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: a retrospective analysis. Cancer. 115 (20), 4715-4726 (2009).
- Gooley, T. A., et al. Reduced Mortality after Allogeneic Hematopoietic-Cell Transplantation. New England Journal of Medicine. 363 (22), 2091-2101 (2010).
- Rosenberg, S. A., et al. Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T cell transfer immunotherapy. Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).
- Aranda, F., et al. Trial Watch: Adoptive cell transfer for anticancer immunotherapy. Oncoimmunology. 3, 28344 (2014).
- Wherry, E. J.
- Ho, P. C., et al. Phosphoenolpyruvate Is a Metabolic Checkpoint of Anti-tumor T Cell Responses. Cell. 162 (6), 1217-1228 (2015).
- Chang, C. H., et al. Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression. Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).
- van der Waart, A. B., et al. Inhibition of Akt signaling promotes the generation of superior tumor-reactive T cells for adoptive immunotherapy. Blood. 124 (23), 3490-3500 (2014).
- Crompton, J. G., et al. Akt inhibition enhances expansion of potent tumor-specific lymphocytes with memory cell characteristics. Cancer Research. 75 (2), 296-305 (2015).
- de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
- Abe, T., et al. Establishment of Conditional Reporter Mouse Lines at ROSA26 Locus For Live Cell Imaging. Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).
- Sukumar, M., et al. Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy. Cell Metabolism. 23 (1), 63-76 (2016).
- Sukumar, M., et al. Inhibiting glycolytic metabolism enhances CD8+ T cell memory and antitumor function. Journal of Clinical Investigation. 123 (10), 4479-4488 (2013).
