Quantificação de Células Proliferativas e Mortas em Enteróides
Summary
O protocolo apresentado utiliza citometria de fluxo para quantificar o número de células proliferantes e mortas em enteróides de camundongos cultivados. Este método é útil para avaliar os efeitos do tratamento medicamentoso sobre a proliferação organoide e a sobrevivência.
Abstract
O epitélio intestinal atua como uma barreira que impede a entrada de conteúdo luminal, como microbiota patogênica e toxinas, de entrar no resto do corpo. A função da barreira epitelial requer a integridade das células epiteliais intestinais. Enquanto a proliferação de células epiteliais mantém uma camada contínua de células que forma uma barreira, danos epiteliais levam à disfunção da barreira. Como resultado, o conteúdo luminal pode atravessar a barreira intestinal através de uma via irrestrita. A disfunção da barreira intestinal tem sido associada a muitas doenças intestinais, como doença inflamatória intestinal. As criptas intestinais de camundongos isolados podem ser cultivadas e mantidas como estruturas semelhantes a criptografia, que são chamadas de organoides intestinais ou “enteróides”. Os enteróides são ideais para estudar a proliferação e a morte celular de células epiteliais intestinais in vitro. Neste protocolo, descrevemos um método simples para quantificar o número de células proliferativas e mortas em enteróides cultivados. 5-etilôndeus-2′-desoxuridina (EdU) e iodeto de propídio são usados para rotular células proliferantes e mortas em enteróides, e a proporção de proliferação e células mortas são então analisadas por citometria de fluxo. Esta é uma ferramenta útil para testar os efeitos do tratamento medicamentoso na proliferação de células epiteliais intestinais e na sobrevivência celular.
Introduction
Uma função fundamental das células epiteliais intestinais é proteger a entrada de conteúdos luminários como bactérias patogênicas e toxinas1,2. Para realizar tal função, as células-tronco intestinais proliferam e se diferenciam continuamente em uma variedade de células epiteliais, incluindo enterócitos e células secretas, que formam uma barreira formando conexões apertadas3. A rápida renovação das células epiteliais intestinais requer coordenação rigorosa da proliferação celular, diferenciação celular e morte celular4,5. A redução da proliferação celular ou a morte celular excessiva leva a danos epiteliais e a função de barreira comprometida1,6. A disfunção da barreira intestinal tem sido associada a doenças inflamatórias intestinais7,8.
Um método para cultivar criptas intestinais foi desenvolvido anteriormente. Usando essa técnica, as criptas de camundongos isolados crescem em organoides intestinais (enteróides), que possuem criptosas como estruturas e contêm toda a linhagem celular epitelial intestinal9,10. 5-Etilnyl-2′-deoxyuridina (EdU) é um analógico de timmidina capaz de substituir a timina (T) no DNA que está passando por replicação durante a proliferação celular. As células proliferativas podem ser rotuladas de forma rápida e precisa pela coloração de EdU. Propidium iodeto (PI) é um análogo de brometo de etídio que libera fluorescência vermelha após inserção em DNA de dupla cadeia. Pi detecta especificamente células mortas, uma vez que só passa pela membrana celular danificada.
Neste protocolo, primeiro descrevemos como isolar criptas do intestino delgado murina e depois cultimá-las como enteróides in vitro. Descrevemos então como analisar as células proliferativas e mortas em enteróides por incorporação e citometria de fluxo da EdU e PI.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo detalha as etapas necessárias para a cultura de enteróides in vitro e quantificação de células EdU e PI-positivas nos enteróides por citometria de fluxo. Há várias vantagens dessa estratégia. Primeiro, a rotulagem EdU é usada para detectar células proliferadoras em enteróides. Em comparação com o ensaio tradicional da BrdU, o método de rotulagem EdU é mais rápido, mais sensível e mais preciso. EdU é muito semelhante à timina (T), que substitui a timina na síntese de DNA durante a divis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é apoiado pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (31971062, 31900326 e 31601022), Fundação de CiênciaNatural da Província de Jiangsu (BK20190043, BK20180838), Fundo de Pesquisa do Laboratório Estadual-Chave de Biotecnologia Farmacêutica, Universidade de Nanjing (KF-GN-202004). A Fundação de CiênciaNatural das Instituições de Ensino Superior de Jiangsu da China (19KJB320003), o Programa de Subsistência e Tecnologia da cidade de Suzhou (SYS2019030) e o Programa de Inovação em Pesquisa para Graduados Universitários da Província de Jiangsu (KYCX19-1981) . Este trabalho também é apoiado pela Tang Scholar da Universidade de Soochow.
Materials
| 15 ml centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 22 G gavage needle | VWR | 20068-608 | |
| 24-well plate | Nunc | 142475 | |
| 40 mm sterile cell strainer | BD | 352340 | |
| 50 ml centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| 70 mm sterile cell strainer | BD | 352350 | |
| Advanced DMEM/F-12 | GIBCO | 12634010 | |
| Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer | Invitrogen | A24863 | |
| B-27 Supplement | GIBCO | 17504044 | |
| Buffer 1 | 2 mM EDTA in DPBS | ||
| Buffer 2 | 54.9 mM D-sorbitol, 43.4 mM sucrose in DPBS | ||
| C57/B6 mice | Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University | ||
| Cell-dissociation enzymes (TrypLE) | Life technologies | 12605-010 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Life technologies | C10639 | |
| CO2 incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| DPBS | GIBCO | 14190144 | |
| D-sorbitol | BBI | SB0491 | |
| EDTA | BBI | EB0185 | |
| ENR media | Minigut media, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| Fine Iris Scissors | Tansoole | 2037454 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | FV1000 | |
| GlutaMAX Supplement | GIBCO | 35050-061 | |
| Goat Serum | Life technologies | 16210-064 | |
| HDMEM | Hyclone | SH30243.01B | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| Minigut media | Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 units/ml), 10 mM Hepes, N2 supplement (1:100), B27 supplement (1:50) | ||
| N2 supplement | R&D | AR009 | |
| Nonionic surfactant (Triton X) | BBI | TB0198-500ML | |
| Operating Scissor (12.5 cm) | Tansoole | 2025785 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | sigma | 158127-500g | |
| Penn/Strep | Invitrogen | 15140-148 | |
| Phase contrast microscope | Nikon | TS1000 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170-25MG | |
| Recombinant EGF | PeproTech | 315-09 | |
| Recombinant Mouse Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D | 3474-RS-050 | |
| Recombinant Murine IL-22 | PeproTech | 210-22-10 | |
| Sucrose | BBI | SB0498 | |
| Tissue Forceps | Tansoole | 2026704 | |
| Y-27632 2HC1 | Selleck | S1049 |
References
- Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target. Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14 (1), 9-21 (2017).
- Buckley, A., Turner, J. R. Cell Biology of Tight Junction Barrier Regulation and Mucosal Disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), (2018).
- Gehart, H., Clevers, H. Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells. Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).
- Vancamelbeke, M., Vermeire, S. The intestinal barrier: a fundamental role in health and disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).
- Garcia-Carbonell, R., Yao, S. J., Das, S., Guma, M. Dysregulation of Intestinal Epithelial Cell RIPK Pathways Promotes Chronic Inflammation in the IBD Gut. Frontiers in Immunology. 10, 1094 (2019).
- Li, B. R., et al. In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), e57032 (2018).
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature Reviews Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).
- Graham, W. V., et al. Intracellular MLCK1 diversion reverses barrier loss to restore mucosal homeostasis. Nature Medicine. 25 (4), 690-700 (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
- Friedrich, M., Pohin, M., Powrie, F. Cytokine Networks in the Pathophysiology of Inflammatory Bowel Disease. Immunity. 50 (4), 992-1006 (2019).
- Zha, J. M., et al. Interleukin 22 Expands Transit-Amplifying Cells While Depleting Lgr5 Stem Cells via Inhibition of Wnt and Notch Signaling. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7 (2), 255-274 (2019).
