Um ensaio de liposcopia única baseado em microscopia quantitativa para detectar a inhomogeneidade composicional entre lipossomos individuais
Summary
Este protocolo descreve a fabricação de lipossomas e como estes podem ser imobilizados em uma superfície e imagemindividualmente de uma forma paralela maciça usando microscopia de fluorescência. Isso permite a quantificação do tamanho e inhomogeneidade composicional entre os lipossomos únicos da população.
Abstract
A maioria das pesquisas que empregam lipossomas como sistemas de modelo de membrana ou portadores de entrega de drogas depende de técnicas de leitura em massa e, portanto, assume intrinsecamente todos os lipossomas do conjunto para ser idêntico. No entanto, novas plataformas experimentais capazes de observar lipossomos no nível de partículaúnica tornaram possível realizar estudos altamente sofisticados e quantitativos sobre interações de membrana proteica ou propriedades de portadores de drogas em lipossomos individuais, evitando assim erros da média do ensemble. Aqui apresentamos um protocolo para preparar, detectar e analisar lipossomos individuais usando um ensaio microscopia à base de fluorescência, facilitando tais medições de partículas únicas. A configuração permite a imagem de lipossomos individuais de forma paralela maciça e é empregada para revelar o tamanho intra-amostral e inhomogeneidades composicionais. Além disso, o protocolo descreve as vantagens de estudar lipossomas no nível único de lipossoma, as limitações do ensaio e as características importantes a serem consideradas ao modificá-lo para estudar outras questões de pesquisa.
Introduction
Os lipossomas são vesículas à base de fosfolípido esféricas que são fortemente utilizadas tanto na pesquisa básica quanto aplicada. Funcionam como sistemas excelentes do modelo da membrana, porque suas propriedades physiochemical podem facilmente ser manipuladas variando os componentes lipídicos que compõem o liposome1,2. Além disso, os lipossomas constituem o sistema de nanocarrier de entrega de medicamentos mais utilizado, oferecendo farmacocinética melhorada e farmacodinâmica, bem como alta biocompatibilidade3.
Por muitos anos, os lipossomas têm sido estudados principalmente usando técnicas a granel, dando apenas acesso a valores médios de leitura do conjunto. Isso levou a maioria desses estudos a assumir que todos os lipossomas do conjunto são idênticos. No entanto, esses valores medianos pelo conjunto só estão corretos se o conjunto de dados subjacente for distribuído uniformemente em torno do valor médio, mas pode representar uma conclusão falsa e tendenciosa se o conjunto de dados incluir várias populações independentes, por exemplo. Além disso, assumindo que o conjunto significa representar toda a população pode ignorar as informações abrigadas dentro da inhomogeneidade entre os lipossomas. Só recentemente surgiram ensaios quantitativos que são capazes de sondar lipossomos individuais, revelando grandes inhomogeneidades entre os lipossomos individuais no que diz respeito a importantes propriedades fisicoquímicas, incluindo o tamanho lipossoma4,composição lipídica5,6, e eficiência de encapsulamento7, destacando a importância de estudar liosomos no nível lipossoma único.
Uma área de pesquisa onde a média do conjunto de propriedades lipossoma tem sido mostrado para os resultados viés está estudando lipossoma tamanho dependente de interações de membrana de proteína8,9. Tradicionalmente, os pesquisadores que estudam tais processos têm sido restritos a preparar lipossomas com diferentes diâmetros médios conjunto por extrusão através de filtros com diferentes tamanhos de poros9. No entanto, extrair o diâmetro dos lipossomos individuais usando ensaios lipososos únicos revelou grandes sobreposições populacionais, com lipossomos extrudados usando filtros de 100 nm e 200 nm exibindo até 70% de sobreposição em sua distribuição de tamanho4. Isso poderia influenciar severamente as medições em massa de interações de membrana de proteína dependentes do tamanho dos lipososos10. Realizando os estudos de interação membrana-proteína usando o único ensaio lipossoma, os pesquisadores aproveitaram a polidispersão de tamanho dentro da amostra, permitindo-lhes estudar uma ampla gama de diâmetros lilíticos dentro de cada experimento, facilitando novas descobertas de como a curvatura e a composição da membrana podem afetar o recrutamento de proteínas nas membranas4,11,12. Outro campo onde a aplicação de ensaios lipososos únicos tem provado instrumental está em estudos mecanicistas de fusão de membrana mediada porproteínas 13,14. Para tais medições cinéticas, a capacidade de estudar eventos de fusão individuais aliviou a necessidade de sincronização experimental do processo de fusão, permitindo novos insights mecanicistas que de outra forma teriam sido perdidos na média spatiotemporal feita em medições de conjuntos a granel. Além disso, os lipossomos individuais têm sido utilizados como andaime de membrana, permitindo a medição de proteínas individuais e oferecendo novos conhecimentos sobre a dinâmica estrutural da proteína transmembrana15,16. Além disso, tais configurações à base de proteolipossoma tornaram possível estudar a função dos transportadores transmembranaindividuais17 e complexos proteicos formadores de poros18, bem como o mecanismo de peptídeos bioativos de membrana permeabilizante19. Os únicos lipossomos também têm sido usados como nanofluídicos de matéria macia com lipossomos únicos imobilizados pela superfície servindo como câmaras para reações enzimáticas em volumes de10-19 L, aumentando a fonte e a complexidade dos ensaios de triagem com consumo mínimo de produtos20.
Recentemente, os únicos ensaios lipossoma foram usados caracterizando lipossomos da entrega da droga em um nível previamente unprecendented de detalhe. Os pesquisadores foram capazes de quantificar inhomogeneidades significativas na quantidade de polímero ligado à superfície dos lipossomos individuais21. Os únicos ensaios lipossoma também permitiram medições de lipossomos de entrega de drogas em mídias complexas, como plasma sanguíneo, revelando como elementos ancorados à superfície lipossoma através de âncoras lipídicas podem ser suscetíveis à dissociação quando os lipossomas são expostos a condições que imitam aqueles experimentados durante a circulação vivo22. No geral, a versatilidade e utilidade dos únicos ensaios liúlio são fundamentados pela grande variedade de problemas que essas configurações foram empregadas para resolver, e prevemos que a metodologia continuará a ser desenvolvida e encontrará uso em novos campos científicos.
Aqui descrevemos um ensaio liposcoso único baseado em microscopia de fluorescência que permite que os lipossomas individuais sejam estudados de forma de alta despersistência (Figura 1). Para ilustrar o método, nós o usamos para quantificar o tamanho e a inhomogeneidade composicional entre lipossomos individuais dentro de um conjunto. O ensaio emprega imagens de microscópio de fluorescência de lipossomos únicos imobilizados em uma superfície de vidro passivado. Primeiro descrevemos os passos críticos no processo de fabricação de lipossoma que garante rotulagem e imobilização de liposos fluorescentes adequadas. Em seguida, descrevemos a preparação superficial necessária para facilitar a imobilização dos lipossoma antes de delinear o procedimento para garantir densidades de superfície lipossoma apropriadas. Discutimos os parâmetros de microscopia importantes para a aquisição de imagens de alta qualidade e delineamos como realizar análises de dados simples, permitindo a extração de tamanho lilímico e inhomogeneidade composicional. Este protocolo genérico deve fornecer uma boa base para o pesquisador interessado para desenvolver o ensaio ainda mais para o seu interesse de pesquisa específico.
Protocol
Representative Results
Discussion
É importante notar que, embora descrevamos em detalhes como o ensaio único dos lipossomas pode ser usado para estudar a inhomogeneidade composicional entre os lipossomas individuais, a plataforma é muito versátil. Como mostrado anteriormente e discutido na introdução, o protocolo pode ser facilmente adaptado para estudar aspectos da fusão membrana-membrana, interações proteína-membrana ou caracterização lipossômica do portador de drogas. Para quaisquer questões científicas que estão sendo abordadas, o pod…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo Conselho Dinamarquês para a Investigação Independente [número de subvenção 5054-00165B].
Materials
| 8-well microscopy slides (µ slides) | Ibidi | 80827 | Microscopy slides with glass bottom |
| Avanti Mini Extrusion kit | Avanti Polar Lipids | 610000 | Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| BSA-Biotin | Sigma | A8549 | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000 | Traded trough Sigma |
| Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ) | ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data | ||
| DOPE-Atto488 | Atto-Tech | AD488-165 | |
| DOPE-Atto655 | Atto-Tech | AD655-165 | |
| DOPE-PEG-Biotin | Avanti Polar Lipids | 880129 | Traded trough Sigma |
| D-Sorbitol | Sigma | S-6021 | |
| Freeze-dryer | e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene | ||
| Glass vials | Brown Chromatography | 150903 | Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit |
| HCl | Honeywell Fluka | 258148 | |
| Heating bath | Capable of heating to minimum 65C | ||
| Heating plate w. Magnet stirring | Capable of heating to minimum 65C | ||
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Liquid nitrogen | Including container for storage, e.g. Rubber-bath | ||
| Magnetic stirring bars | VWR | 442-4520 (EU) | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030 120.086 (EU) | |
| Microscope | For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used | ||
| Na HEPES | Sigma | H7006 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| NaOH | Honeywell Fluka | 71686 | |
| POPC | Avanti Polar Lipids | 850457 | Traded trough Sigma |
| Streptavidin | Sigma | S4762 | |
| tert-Butanol (2-methyl-2-propanol) | Honeywell Riedel-de Haën | 24127 | |
| Ultrapure water | e.g. MilliQ |
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