去勢耐性前立腺癌患者からのホルマリン固定組織および血清由来エキソソームからの小型非コードRNAのシーケンシング
Summary
治療抵抗性は進行前立腺癌の患者で発症することが多く、場合によっては、癌は神経内分泌前立腺癌と呼ばれる致死的なサブタイプに進行する。この遷移を促進する小さな非コーディングRNA媒介分子変化を評価することは、神経内分泌前立腺癌の発症につながる因果メカニズムのより良い疾患階層化および同定を可能にするであろう。
Abstract
アンドロゲン剥奪によるアンドロゲン受容体(AR)シグナル伝達のアブレーションは、最初に癌の退行をもたらす前立腺癌の治療の最初のラインの目標です。しかし、かなりの数の症例において、疾患は進行した去勢抵抗性前立腺癌(CRPC)に進行し、治療の選択肢が限られており、しばしば攻撃的である。遠い転移は、主に攻撃的な疾患のこの段階で観察される。CRPCは、最初は生存を改善する第2世代のAR経路阻害剤によって治療され、その後、治療抵抗性の出現が続く。神経内分泌前立腺癌(NEPC)は、しばしば神経内分泌分化(NED)として知られているトランス分化プロセスを介して治療抵抗性の結果として発症する前立腺癌(PCa)の稀な変異体であり、PCa細胞は系統スイッチを受ける腺癌から、神経内分泌(NE)系統マーカーの発現の増加を示す。NEPCへの進行とトランス分化を促進するゲノム変化に加えて、エピジェネティックな要因と微小環境の手掛かりは、疾患の進行を促進する上で不可欠なプレーヤーと考えられています。この原稿は、高度なPCaに関連するエピジェネティックドライバ(すなわち、小さな非コーディングRNA)を識別するための詳細なプロトコルを提供します。ホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)転移組織および対応する血清由来細胞外小胞(EV)からの精製マイクロRNAを使用して、プロトコルはシーケンシングのための適切な品質管理を備えたライブラリを準備する方法を記述するこれらのサンプルソースからのマイクロRNA。FFPE と EV の両方から RNA を分離することは、ほとんどの RNA が劣化しているか、または量が制限されているため、多くの場合困難です。このプロトコルでは、RNA入力とcDNAライブラリを最適化して、シーケンス時に最も具体的な読み取りと高品質のデータを得るためのさまざまな方法について詳しく説明します。
Introduction
前立腺癌は、ARシグナル伝達を介して作用するアンドロゲンによって駆動される。従って、AR経路を標的とすることは、疾患1の主力治療法である。しかし、耐性は、標的療法の結果としてしばしば起こり、疾患は進行性転移性CRPC2に進行する。CRPCは、エンザルタミドとアビラテロン2、3を含む第2世代のAR療法によって治療され、最初は生存を改善する。しかし、NEPCのような致死的な変異体は、治療オプションが限られている治療CRPC症例の25~30%に出現することが多く、死亡率3の増加につながる。NEPCは、NEDとして知られる可逆的トランス分化プロセスを介して生じ、ここでPCa細胞は腺癌からの系統スイッチを受け、ARの発現の減少およびエノラーゼ2(ENO2)、クロクロニンA(CHGA)、およびシナプトフィシン(SYP)4を含むNE系統マーカーの発現の増加を示す。これらの耐性変異体が治療介入の結果として生じることを考えると、PCaの治療が困難なこの致命的な、治療が困難な生成につながる経路を解読することが不可欠である。
NEPCのゲノムは最近、Beltranらによって行われた徹底的な研究で解読され、それによってコピー数の変化、突然変異、単一ヌクレオチド多型(SN)、および患者由来転移組織からのDNAメチル化が分析された5。この積極的な形態のPCaのゲノムの理解が著しく進歩しているにもかかわらず、CRPC-腺癌からNEPCへの移行に関与する小さな非コードRNA(microRNA)を含むエピジェネティックな要因についてはほとんど知られていない。マイクロRNA(miRNA)は、コグネイトmRNA標的6の3′-非翻訳領域(UTR)との配列特異的相互作用によって主に転写後の遺伝子発現を抑制することによって作用する22bp長い、二本鎖RNAである。いくつかの腫瘍および腫瘍抑制剤が同定され、疾患発症および転移を調節するその役割は、異なる癌6、7においてよく研究されている。これらの小さな非コーディングRNAは、多くの場合、疾患死亡率6、8、9を制御する上で非常に重要なターゲットとして機能します。最近の研究は、エキソソームのようなEVにおける輸送を介した癌転移におけるmiRNAのパラクリン効果を理解することに焦点を当てており、その血流中を流れ、腫瘍細胞がこれらの二次メッセンジャーをヌクレアーゼフリー環境10、11、12の転移位置に送ることを可能にする。EVは、宿主細胞12から形容作用を伝達するために腫瘍細胞からmiRNAを運ぶ。したがって、腫瘍細胞の二次メッセンジャーとしてのEVの同定は、疾患重症度の非侵襲的検出に有用である可能性がある。
miR-1246は、積極的なPCaからEVで高度にアップレギュレーションされ、疾患重症度13を示す。これらのEV関連miRNAは、疾患の非侵襲的バイオマーカーとして機能するだけでなく、腫瘍形成を駆動する上で機能的に重要な役割を果たす。したがって、非侵襲的バイオマーカーとその機能的意義をより良く同定できるように、PCaの耐性形態に関連するmiRNAレパートリーの意義を理解することが不可欠です。
次世代シーケンシングの出現は、突然変異、染色体転位、染色体上昇、メチル化などのゲノムの変化を含む腫瘍景観の詳細を研究するための最も包括的なプラットフォームを提供し、そのすべてが癌14、15、16の形態および性質に大きく寄与する。同様に、腫瘍細胞で起こり、疾患重症度17の重要なプレーヤーであることが多い膨大なエピゲノム変化を理解することも不可欠なツールです。NEPCの生成に関連するmiRNAレパートリーを理解することを目的として、FFPE転移CRPC組織およびそれに対応する血清由来EVに対して小さなRNAシーケンシングを行った。これら2つのサンプル源のいずれかに由来するRNAは、(1)収率が低く、(2)ホルマリン固定およびEV分離のためにしばしば起こる劣化による悪品質である。さらに、cDNAライブラリの生成は、シーケンス実行の重要ですが、面倒なステップです。したがって、これらのRNAを分離し、それらを使用して小さなRNAシーケンシング用のライブラリを生成する方法は、正確で信頼性の高いデータを生成するための最適化が必要です。
RT-PCR、マイクロアレイ、インシトゥハイブリダイゼーション(ISH)など、さまざまなサンプルでmiRNA発現をプロファイリングする方法がいくつかあります。FFPE組織由来RNAを用いてRT-PCRおよびISHによるmiRNA発現を評価するプロトコルが最近公開された18.最近の技術は、サンプルでmiRNA発現をプロファイリングするためのより包括的で包括的なプラットフォームを提供します。NanoString nCounterは、感度の高いmiRNA検出プラットフォーム19を提供していますが、検出は、多くの場合、アレイで利用可能なmiRNAの数(〜2,000)によって制限されます。このようなシナリオでは、次世代シーケンシングのようなより敏感で網羅的なプラットフォームは、異なるサンプル20におけるmiRNA同定および同時プロファイリングのはるかに広い深さを提供する。この方法は、PCa患者21、22、23からの尿または血漿中のmiRNAシグネチャを決定するために使用されている。現在の記事では、FFPE組織と血清由来EVRNAを使用して積極的なCRPCに関連するmiRNAプロファイルを研究するために、次世代シーケンシングプラットフォームを使用するプロトコルが提示されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
この記事では、単離されたRNAの収率と品質を高めるために最適化されたキットを使用して、FFPE組織および血清由来EVからRNAを分離するプロトコルについて説明します。さらに、精製されたRNAを用いて、小型RNAシーケンシング用のcDNAライブラリーを生成した。リストされている両方のステップは、実行24からの最終結果であるシーケンス読み取りの品質と深さを決定する際に?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、米国陸軍医学研究買収活動(USAMRAA)が、受賞番号のアイデア開発賞を通じて支援しています。W81XWH-18-1-303およびW81XWH-18-2-0013およびさらに賞番号によって。W81XWH-18-2-0015、W81XWH-18-2-0016、W81XWH-18-2-0017、W81XWH-18-2-0018、およびW81XWH-18-2-0018、およびW81XWH-18-2-0019前立腺癌バイオリポジトリネットワーク(PCBN)。国立衛生研究所の国立がん研究所(助成金番号RO1CA177984)による著者研究室への資金援助も認めされています。Rajvir Dahiyaは、BX004473退役軍人省のシニアリサーチキャリアサイエンティストであり、NIH-UO1CA199694(RD)の資金提供を受けています。意見、解釈、結論、および勧告は著者のものであり、必ずしも国防総省または米国陸軍によって承認されるものではありません。サンフランシスコVAMCの中核施設ディレクターであるジュディ・シゲナガ氏が、NextSeq 500シーケンサーの支援をいただいたことに感謝しています。
Materials
| 3M NaOAc pH 5.5 | USB Corp. | 75897 100 mL | |
| 5 µm filter tubes | IST Engineering Inc. | 5388-50 | |
| 6% TBE polyacrylamide gels | Novex | EC6265BOX | |
| BaseSpace | Illumina | Analysis software | |
| Bio-analyzer | Agilent | ||
| DNA loading dye | Novex | LC6678 | |
| Eppendorf Thermostat plus | Eppendorf 1.5 mL | ||
| EtBr | Pierce | 17898 | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Pharmco | 111000200 | |
| Exosomal RNA isolation kit | Norgen | 58000 | |
| Gel breaking tubes | IST Engineering Inc. | 3388-100 | |
| Glycogen molecular biology grade | Thermo Scientifc | R0561 | |
| Hematoxylin Select | Stat lab | SL401 | |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | 13-100-676 | accuSpin Micro 17R |
| miRNeasy FFPE kit | Qiagen | 217504 | |
| Nanodrop | Thermo Scientifc | Nano Drop 1000 | |
| Nanosight NTA | Malvern | LM14 | |
| NextSeq 500 Sequencer | Illumina | ||
| NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles) | Illumina | FC-404-2001 | |
| Pellet paint | Millipore | 70748-3 | |
| Superscript II Reverse Transcriptase | Invitogen | 18064014 | |
| T4 RNA Ligase 2 Deletion Mutant | Lucigen | LR2D11310K | |
| TBE Running buffer (5X) | Novex | LC6675 | |
| Thermal cycler | MJ Research | PTC100 | |
| Total exosome isolation reagent (from serum) | Invitrogen | 4478360 | |
| TrueSeq small RNA library Prep kit-Set A (Indexes 1-12) | Illumina | RS-200-0012 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3P- 1GAL | |
| RNA 3' Primer | GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC | ||
| RNA 5' Primer | TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG | ||
| Stop Oligo | GAAUUCCACCACGUUCCCGUGG | ||
| RNA RT Primer | GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | ||
| RNA PCR Primer | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA | ||
| RNA PCR Index Primer | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[6 bases]GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | ||
| – | – | – | 6 bases in adapter |
| RNA PCR Index Primer 1 | CGTGAT | ||
| RNA PCR Index Primer 2 | ACATCG | ||
| RNA PCR Index Primer 3 | GCCTAA | ||
| RNA PCR Index Primer 4 | TGGTCA | ||
| RNA PCR Index Primer 5 | CACTGT | ||
| RNA PCR Index Primer 6 | ATTGGC | ||
| RNA PCR Index Primer 7 | GATCTG | ||
| RNA PCR Index Primer 8 | TCAAGT | ||
| RNA PCR Index Primer 9 | CTGATC | ||
| RNA PCR Index Primer 10 | AAGCTA | ||
| RNA PCR Index Primer 11 | GTAGCC | ||
| RNA PCR Index Primer 12 | TACAAG |
References
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