Summary

Effiziente neuronale Differenzierung mit einzelzellischer Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen

Published: January 18, 2020
doi:

Summary

Hier wird ein Protokoll zur Erzeugung einer einzelzelligen Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen und deren anschließende Differenzierung in neuronale Vorläuferzellen vorgestellt. Das Protokoll ist einfach, robust, skalierbar und eignet sich für Arzneimittelscreenings und anwendungen in der regenerativen Medizin.

Abstract

Die In-vitro-Differenzierung menschlicher embryonaler Stammzellen (hESCs) hat die Fähigkeit verändert, die menschliche Entwicklung sowohl auf biologischer als auch auf molekularer Ebene zu untersuchen, und Zellen für den Einsatz in regenerativen Anwendungen bereitgestellt. Standardansätze für die hESC-Kultur, die Koloniekultur verwendet, um undifferenzierte hESCs und embryoiden Körper (EB) und Rosettenbildung zur Differenzierung in verschiedene Keimschichten aufrechtzuerhalten, sind ineffizient und zeitaufwändig. Hier wird eine Einzelzellkulturmethode vorgestellt, die hESCs anstelle einer Koloniekultur verwendet. Diese Methode ermöglicht die Aufrechterhaltung der charakteristischen Merkmale undifferenzierter hESCs, einschließlich der Expression von hESC-Markern auf Ebenen, die mit Kolonietyp-hESCs vergleichbar sind. Darüber hinaus stellt das Protokoll eine effiziente Methode für die Generierung von neuronalen Vorläuferzellen (NPC) aus einzelligen hESCs dar, die NPCs innerhalb einer Woche produziert. Diese Zellen exprimieren in hohem Maße mehrere NPC-Markergene und können sich in verschiedene neuronale Zelltypen differenzieren, einschließlich dopaminergen Neuronen und Astrozyten. Dieses einzellige Kultursystem für hESCs wird nützlich sein, um die molekularen Mechanismen dieser Prozesse, Studien zu bestimmten Krankheiten und Drogenentdeckungs-Screens zu untersuchen.

Introduction

Menschliche embryonale Stammzellen (hESCs) haben das Potenzial, sich in die drei primären Keimschichten zu differenzieren, die sich dann in verschiedene multipotente Vorläuferzelllinien differenzieren. Diese Abstammungen führen in der Folge zu allen Zelltypen im menschlichen Körper. In-vitro-hESC-Kultursysteme haben die Fähigkeit, die menschliche embryonale Entwicklung zu untersuchen, verändert und als wertvolles Instrument gedient, um neue Erkenntnisse darüber zu erhalten, wie diese Prozesse auf biologischer und molekularer Ebene reguliert werden. In ähnlicher Weise liefern Studien mit induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs), die aus der Reprogrammierung sammatischer Zellen, die von menschlichen Patienten isoliert wurden, generiert wurden, neue Einblicke in verschiedene Krankheiten. Darüber hinaus können Vorläufer und differenzierte Zellen, die aus hESCs gewonnen werden, für die Forschung mit Stammzelltherapie und Arzneimittelscreening1,2,3,4nützlich sein.

hESCs können induziert werden, um sich in neuronale Vorläuferzellen (NPCs) zu differenzieren, die Multipotentialzellen mit einer umfangreichen Selbsterneuerungskapazität sind. Anschließend können diese Zellen in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten 5,6unterschieden werden. NPCs bieten auch ein zelluläres System für In-vitro-Studien der Neuroentwicklungsbiologie und verschiedeneneurologische Erkrankungen. Die derzeitigen Koloniekulturmethoden, die hESCs und ihre Differenzierung in NPCs beinhalten, sind jedoch ineffizient und beinhalten häufig Kokultur sowie Embryoidenkörper (EB) und Rosettenbildung5,7,8,9. Diese Protokolle weisen niedrigere Überlebensraten und spontane Differenzierung auf und sind zeitaufwändiger.

Hier wird ein verbessertes und robustes Kultursystem vorgestellt, das leicht skalierbar ist und eine einzellige Kultur mit hoher Dichte von hESCs10verwendet. Die Einbeziehung von Rohkinase (ROCK) Inhibitor trug zur deutlich verbesserten Überlebenseffizienz während der einzelzelligen Typkultur von hESC10,11,12,13,14. In diesem Kultursystem können hESCs einfach gewartet und erweitert werden. Darüber hinaus stellt das Protokoll eine effiziente Methode zur Generierung von NPCs aus einer einzelligen Typkultur von hESCs dar, die die Produktion von hochreinen NPCs ermöglicht. Hemmung von BMP/TGF/Activin-Signalwegen mit ALK-Inhibitoren induziert effizient die Differenzierung von einzelligen HESCs in NPCs15,16, die dann induziert werden können, um sich in funktionelle neuroale Leitungen wie dopaminerische Neuronen zu differenzieren.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Einzelzelltypkulturprotokoll mit hESCs ein attraktives Modell bietet, um die Differenzierung dieser Zellen in verschiedene Linien, einschließlich NPCs, zu untersuchen. Dieses Protokoll ist leicht skalierbar und daher für die Erzeugung von Zellen für die Forschung mit regenerativer Therapie und Arzneimittelscreening geeignet.

Protocol

1. Herstellung von hESC-qualifizierten Basement Membrane Matrix-beschichteten Platten Langsam die hESC-qualifizierte Kellermembranmatrix (siehe Materialtabelle)bei 4 °C mindestens 2–3 h oder über Nacht auftauen, um die Bildung eines Gels zu vermeiden. Zur Herstellung von Kellermembran-Matrix-beschichteten Platten die Matrix in kalter DMEM/F12 auf eine Endkonzentration von 2% verdünnen. Gut mischen und jeden Brunnen einer 6-Well-Platte mit 1 ml der verdünnten Matrixlösung beschi…

Representative Results

Hier wird ein verbessertes Protokoll zur Erhaltung und Erweiterung der einzelligen Typkultur von hESCs und deren effizienter Differenzierung in neuronale Vorläuferzellen vorgestellt, die sich anschließend in verschiedene nachgeschaltete neuronale Linien differenzieren. einschließlich dopaminergen Neuronen und Astrozyten. Repräsentative Phasenkontrastbilder zeigen die Zellmorphologie in verschiedenen Schritten während der Anpassung von Kolonietyp hESCs an die einzellige Typkultur (<strong …

Discussion

Skalierbare und effiziente Methoden zur Differenzierung von hESCs in verschiedene Linien und die Erzeugung einer ausreichenden Anzahl differenzierter Zellen sind wichtige Kriterien für das Arzneimittelscreening und die Stammzelltherapie. Verschiedene einzellige Passmethoden wurden veröffentlicht, bei denen Zellen in Gegenwart von ROCK-Hemmern oder anderen kleinen Molekülen kultiviert werden, um das Überleben zu verbessern, aber die Endprodukte dieser Kulturmethoden sind Kolonietyp hESCs17

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Dr. Carl D. Bortner (NIEHS) für seine Unterstützung bei der FACS-Analyse. Diese Forschung wurde durch das Intramural Research Program des National Institute of Environmental Health Sciences, der National Institutes of Health, Z01-ES-101585 bis AMJ unterstützt.

Materials

35 mm m-dishes ibidi 81156 Cell culture dish
6-well plates Corning 3516
Accutase Innovative Cell Technologies AT104-500 Cell detachment solution
Activin A R&D system 338-AC-050
Ascorbic Acid Sigma Aldrich A4403
B27 supplement Thermo Fisher 17504044
B27 supplement (-Vit A) Thermo Fisher 12587010
BDNF Applied Biological Materials Z100065
bFGF Peprotech 100-18C
Centrifuge DAMON/ICE 428-6759
CO2 incubator Thermo Fisher 4110
Corning hESC-qulified Matrix (Magrigel) Corning 354277 Basement membrane matrix (used for most of the protocol here)
Cryostor CS 10 Stemcell Technologies 7930 Cell freezing solution
Dispase Stemcell Technologies 7923
DMEM Thermo Fisher 10569-010
DMEM/F12 Thermo Fisher 10565-018
Dorsomorphin Tocris 3093
EGF Peprotech AF-100-16A
Fetal Bovine Serum Fisher Scientific SH3007003HI
FGF8 Applied Biological Materials Z101705
GDNF Applied Biological Materials Z101057
Geltrex matrix Thermo Fisher A1569601 Basement membrane matrix
GlutaMax Thermo Fisher 35050061 Glutamine supplement, 100X
H9 (WA09) human embryonic stem cell line WiCell WA09
Heregulin b-1 Peprotech 100-3
IGF Peprotech 100-11
Knockout DMEM Thermo Fisher 10829018
Knockout Serum Replacement Thermo Fisher 10828028
Laminin Sigma Aldrich L2020
mTeSR1 Stemcell Technologies 85850 hESC culture medium
N2 supplement Thermo Fisher 17502001
NEAA Thermo Fisher 11140050
Neurobasal Thermo Fisher 21103049
Poly-L-ornithine Sigma Aldrich P3655
ROCK inhibitor Tocris 1254
SB431542 Tocris 1614
SHH Applied Biological Materials Z200617
Stemdiff Neural Progenitor medium Stemcell Technologies 5833 NPC expansion medium

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Cite This Article
Jeon, K., Park, K., Jetten, A. M. Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (155), e60571, doi:10.3791/60571 (2020).

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