本文描述了采用甲基化特异性探针扩增法分析经骨肉瘤来源的细胞外囊泡处理的间充质干细胞中LINE-1元件甲基化水平的方法。同时展示了常用于从胎牛血清中分离细胞外囊泡的超速离心法。
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方法文章
骨肉瘤来源细胞外囊泡处理的间充质干细胞中LINE-1甲基化分析
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
甲基化特异性探针扩增（MSPA）是一种简单且稳健的技术，可用于检测DNA样本中甲基化水平的相对差异。该方法资源利用率高，所需DNA量少，实验操作时间约为4–5小时。在本技术中，首先将DNA样本变性，然后与探针杂交，这些探针分别靶向甲基化位点或作为对照的参考位点。杂交后的DNA被分配到平行反应中：一组仅进行连接反应，另一组在连接后进一步接受HhaI介导的消化，以切割未甲基化的GCGC序列。所得DNA片段通过PCR扩增，并经毛细管电泳分离。甲基化的GCGC位点不会被HhaI切割，因而产生峰信号；而未甲基化的GCGC位点则被切割，不产生峰信号。通过比较各样本消化与未消化版本经对照归一化后的峰信号，可获得DNA样本的甲基化剂量比。本文中，MSPA用于检测骨肉瘤来源的细胞外囊泡（EVs）对间充质干细胞中长散布核元件-1（LINE-1）甲基化状态的影响。LINE-1是重复DNA元件，在癌症中通常发生低甲基化，因此可能作为生物标志物。此外，超速离心也被用作一种经济有效的方法，从生物液体中分离细胞外囊泡（例如，在制备无EV胎牛血清[FBS]以及从骨肉瘤条件培养基中分离EV时采用差速离心法）。在甲基化分析中，设计了定制的LINE-1探针，靶向LINE-1启动子序列中的三个甲基化位点和七个对照位点。本方案展示了MSPA在LINE-1甲基化分析中的应用，并描述了通过超速离心制备无EV FBS的方法。
引言
DNA甲基化是人类细胞中主要的表观遗传修饰之一。DNA甲基化是指甲基基团与CpG二核苷酸中的胞嘧啶残基共价结合。这类二核苷酸通常成簇存在于基因的5'区，称为CpG岛1。在正常细胞中，大多数此类二核苷酸处于非甲基化状态，从而允许DNA转录。然而，许多癌症与CpG岛的高甲基化及转录沉默相关2，尤其是在抑癌基因中，这反过来促进了癌症的多种特征性表现3。
另一方面，长散布核元件-1（LINE-1s 或 L1s）是一类重复的可移动DNA元件，通常在CpG岛区域具有高水平的甲基化。LINE-1的甲基化可防止其转位，有助于维持基因组的完整性。在多种癌症中，LINE-1出现低甲基化，导致其被激活，并引发逆转座介导的染色体不稳定性4。LINE-1约占人类基因组的17%5，其甲基化状态可作为全基因组甲基化水平的潜在指标6。全基因组LINE-1低甲基化被认为发生在细胞向肿瘤表型转变之前7，因此有望作为癌症早期发生的潜在标志物。
目前，甲基化分析的方法有多种，包括焦磷酸测序、甲基化特异性 PCR、微阵列以及染色质免....
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方案
本研究经赫尔辛基和新地区医院区伦理委员会批准（伦理批准号 D. No. 217/13/03/02/2015）。
1. 通过超速离心法去除胎牛血清中的细胞外囊泡
- 将FBS加入（超速）离心管中，并放入超速离心机的离心桶内。为确保超速离心过程平稳安全地进行，各离心桶之间的质量需相互平衡，差异不得超过10 mg。
- 将离心桶装入摆动转子（型号SW28，k值为246）中。将转子放入超速离心机，于4 °C下以100,000 × g 离心19小时。
- 小心吸取上清液中颜色较浅的上层液体（约十分之九），转移至一个新的50 mL离心管中。切勿扰动或吸取底部深棕色沉淀物，因其含有来自FBS的细胞外囊泡（EVs）。
- 将上清液通过0.22 µm滤膜过滤至新的50 mL离心管中。
- 在进行细胞外囊泡（EV）分离的细胞培养时，将经过滤除菌且去除EV的FBS加入细胞培养基中。
2. 骨肉瘤来源的细胞外囊泡的分离
- 将骨肉瘤细胞（HOS-143B细胞系）以RPMI 1640培养基接种于T-175培养瓶中，培养基中添加10%正常胎牛血清（FBS）和1%抗生素（100 U/mL青霉素，0.1 mg/mL链霉素）。将培养瓶置于37 °C、5% CO2的培养箱中培养。
- ....
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结果
本研究的主要目标是评估骨肉瘤细胞来源的细胞外囊泡（OS-EVs）对间充质干细胞（MSCs）的表观遗传学影响。OS-EVs 采用标准的差速离心法从 HOS-143B 细胞中分离获得。通过 Western 印迹检测典型的细胞外囊泡标志物 CD63、Hsp70 和 TSG101 的表达，证实了 OS-EVs 的存在（图 2A）。未检测到内质网标志蛋白 calnexin 的信号，表明 OS-EVs 制剂具有较高的纯度。透射电子显微镜（TEM）观察进一步验证了其纯度，结果显示存在多种尺寸的完整囊泡结构（图 2B）。OS-EVs 的平均颗粒浓度为 7.63×1011/mL（图 2C）。EVs 的粒径分布范围为 50–500 nm，其中约 80% 的颗粒粒径集中在 50–200 nm 范围内（图 2
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讨论
本研究展示了如何利用MSPA检测和定量特定遗传元件的甲基化状态。本文以LINE-1为研究对象，但探针可设计用于靶向多种基因和序列。此外，目前已有越来越多适用于不同应用的探针混合物可供选择。MSPA是一种简单且稳健的DNA甲基化分析技术，无需进行亚硫酸氢盐转化10。从样本制备到数据分析的完整流程约需2天，实际操作时间仅需4–5小时。该方法适用于微量DNA（低至70 ng），本文已对此进行了验证。
甲基化分析实验方案中最重要的部分是定制探针混合物的制备，例如本研究中的 LINE-1 探针混合物。由于长度不同，LINE-1 探针的寡核苷酸合成浓度范围为 4–40 nM，因此必须严格按照生产商的说明小心进行溶解步骤及后续稀释25。本研究所采用的 PCR 及多个热循环程序，与原始生产商提供的版本有所不同。
关于 HhaI 酶，有几点注意事项。首先，连接-消化反应体系中所用酶的体积取决于生产厂家，且对热失活具有抗性的酶版本不适.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由赫尔辛基大学项目资助（WBS490302，WBS73714112）、赫尔辛基大学医院大学级健康研究国家资助（Y1014SUL05，TYH2016130）、芬兰-挪威医学基金会以及塞尔玛和玛雅-丽莎·塞尔兰德基金（明娜瓦基金会）提供支持。我们感谢Walter Pavicic提供了改进的MSPA方案及相关技术支持。我们感谢Teemu Masalin（赫尔辛基大学）在视频制作方面给予的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 注射器 | Terumo | SS+01T1 | 用于纳米颗粒跟踪分析（NTA） |
| 24 孔板 | Corning | 3524 | 间充质干细胞（MSC）培养 |
| 3730xl DNA 分析仪 | Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific | 3730XL | |
| 50 mL 离心管 | Corning | 430829 | |
| Beckman Optima LE-80K 超速离心机 | Beckman | ||
| BlueStar 预染蛋白 Marker | Nippon Genetics | MWP03 | WB：蛋白 Marker |
| Calnexin（克隆 C5C9） | Cell Signaling Technology | 2679 | WB，稀释比例 1:800 |
| CD63（克隆 H5C6） | BD Biosciences | 556019 | WB，稀释比例 1:1000 |
| Centrifuge 5702 R | Eppendorf | 5703000010 | 用于条件培养基和细胞 |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | 5810000010 | 用于离心 96 孔板 |
| 离心管（聚烯烃材质，14×95 mm） | Beckman | 331374 | 超速离心 |
| DMEM/F-12 + GlutaMAX 培养基 | Gibco, Life Technologies | 31331-028 | 用于 AT-MSC 培养 |
| 胎牛血清 | Gibco, Life Technologies | 10270-106 | |
| GeneScan 500 LIZ 片段大小标准品 | Applied Biosystems, Life Technologies | 4322682 | 用于毛细管电泳 |
| GenomePlex 完整基因组扩增（WGA）试剂盒 | Sigma | WGA2-10RXN | 用于 MSPA 阴性对照 |
| Hi-Di 去离子甲酰胺 | Applied Biosystems, Life Technologies | 4311320 | 用于毛细管电泳 |
| HOS-143B 细胞系 | ATCC | CRL-8303 | |
| Hsp70（克隆 5G10） | BD Biosciences | 554243 | WB，稀释比例 1:1000 |
| IRDye 800CW 山羊抗小鼠二抗 | Li-Cor | 926-32210 | WB：二抗 |
| IRDye 800CW 山羊抗兔二抗 | Li-Cor | 926-32211 | WB：二抗 |
| LINE-1 探针混合引物 | IDT | 序列见表1 | |
| 带条形码的 MicroAmp 光学 96 孔反应板 | Applied Biosystems, Life Technologies | 4306737 | 还需配备封板膜 |
| Micro BCA 蛋白定量检测试剂盒 | ThermoFisher Scientific | 23235 | 测定蛋白浓度 |
| MiniProtean TGX 10% 凝胶 | Bio-Rad | 456-1034 | WB：凝胶电泳 |
| NanoSight LM14C | Malvern Instruments | 用于纳米颗粒跟踪分析（NTA） | |
| 硝酸纤维素膜，0.2 µm | Bio-Rad | 1620112 | WB：蛋白转膜 |
| NucleoSpin Tissue XS | Macherey-Nagel | 740901.50 | 用于 DNA 提取 |
| Odyssey 封闭缓冲液 | Li-Cor | 927-40000 | WB：封闭，抗体孵育 |
| PBS，1× | Corning | 21-040-CVR | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco, Life Technologies | DE17-602E | 培养基用抗生素 |
| 蛋白 LoBind 管，0.5 mL | Eppendorf | 22431064 | 用于储存细胞外囊泡（Evs） |
| REVERT 总蛋白染色与洗涤试剂盒 | Li-Cor | 926-11015 | WB：总蛋白染色 |
| RKO 细胞系 | ATCC | CRL-2577 | 用于 MSPA 阳性对照 |
| RPMI 1640 + GlutaMAX 培养基 | Gibco, Life Technologies | 61870-010 | 用于 HOS-143B 细胞培养 |
| SALSA MLPA HhaI 酶 | MRC-Holland | SMR50 | |
| SALSA MLPA 试剂盒 | MRC-Holland | EK1-FAM | |
| SALSA MLPA P300 探针混合液 | MRC-Holland | P300-100R | |
| SW-28 摆动转子 | Beckman Coulter | 342207 | 超速离心 |
| 注射器滤器，0.22 µm | Jet Biofil | FPE-204-030 | 用于胎牛血清（FBS）无菌过滤 |
| Tecnai 12 | FEI Company | 配备 Gatan Orius SC 1000B CCD 相机 （Gatan Inc., USA）；用于透射电子显微镜（TEM） | |
| TBS，1× 片剂 | Medicago | 09-7500-100 | WB：缓冲液 |
| Trans-Blot Turbo | Bio-Rad | WB：转膜 | |
| 热循环仪 | ThermoFisher Scientific | TCA0096 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | 用于细胞消化 |
| TSG101（克隆 4A10） | Sigma | SAB2702167 | WB，稀释比例 1:500 |
参考文献
- Esteller, M. Cancer epigenomics: DNA methylomes and histone-modification maps. Nature Reviews Genetics. 8, 286-298 (2007).
- Herman, J. G., Baylin, S. B. Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation. New England Journal....
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重印与许可
