使用光明场显微镜定量拉瓦尔斑马鱼的肝脏大小
Summary
在这里，我们演示了一种量化幼虫斑马鱼肝脏大小的方法，提供了一种评估遗传和药理操作对肝脏生长和发育的影响的方法。
Abstract
在肝细胞癌（HCC）的几个转基因斑马鱼模型中，在早期幼虫阶段可以观察到肝球菌。在斑马鱼HCC模型中量化幼虫肝大小提供了一种快速评估药物和其他操作对与基因相关的表型的影响的方法。在这里，我们展示如何修复斑马鱼幼虫，解剖肝脏周围的组织，使用明亮的显微显微镜拍摄肝脏，测量肝脏面积，并分析结果。该协议能够快速、精确地定量肝脏大小。由于这种方法涉及测量肝脏面积，它可能会低估肝脏体积的差异，并且需要补充方法来区分细胞大小的变化和细胞数的变化。本文描述的解剖技术是一个很好的工具，用于可视化肝脏、肠道和胰腺的自然位置，用于各种下游应用，包括免疫荧光染色和原位杂交。所述的量化幼肝大小的策略适用于肝脏发育和再生的许多方面。
Introduction
肝细胞癌（HCC）是肝脏1最常见的原发性恶性肿瘤，是导致癌症相关死亡的第三大原因2。为了更好地了解肝癌的机理和识别潜在的HCC治疗，我们和其他人已经开发出转基因斑马鱼，其中肝细胞特异性表达的肿瘤基因，如β-卡泰宁3，4，克拉斯（V12）5，6，Myc7，或Yap18导致成年动物的HCC。在这些斑马鱼中，肝增增早在受精后6天（dpf），为测试药物和基因改变对卵基因驱动肝过度生长的影响提供了一个方便的平台。准确和精确测量幼虫肝大小对于确定这些操作的影响至关重要。
肝脏大小和形状可以半定量评估在固定斑马鱼幼虫由CY3-SA标签9或活斑马鱼幼虫使用肝细胞特异性荧光报告机和荧光解剖显微镜5，6。后一种方法比较快，使用图像处理软件7、10拍摄和测量每个肝脏的面积，可以解决其精度不足的问题。然而，在实验中统一定位所有活幼虫，使二维肝区准确表示肝脏大小，在技术上可能具有挑战性。一种类似的量化肝脏大小的技术包括使用光片荧光显微镜来量化幼虫肝体积8，当肝脏在不同维度上不均匀地扩张时，这可能更准确检测大小差异。荧光活化细胞分拣（FACS）可用于计算幼肝8、11中荧光标记肝细胞和其他肝细胞类型的数量。在这种方法中，幼虫肝被集中和分离，因此有关单个肝脏大小和形状的信息丢失。结合另一种肝大小测定方法，FACS 能够区分增加的细胞数（增生）和增加的细胞大小（肥大）。所有这些方法都采用昂贵的荧光技术（显微镜或细胞分拣机），除 CY3-SA 标签外，还需要用荧光报告器标记肝细胞。
在这里，我们详细介绍了使用明场显微镜和图像处理软件3，12，13，14量化斑马鱼幼肝区域的方法。该协议允许在原位对单个肝脏区域进行精确定量，而无需使用荧光显微镜。在分析肝脏大小时，我们盲注图像特征，以减少研究者的偏见，提高科学严谨性。
Protocol
Representative Results
Discussion
肝脏大小的定量对于旨在了解肝脏发育、再生和肿瘤发生的研究至关重要。这里描述的方案是一种相对快速、简单和廉价的幼虫斑马鱼肝脏大小定量技术。在执行协议的某些方面时，适当谨慎行事有助于提高结果的准确性并减少挫折感。
正确固定幼虫对于获得保存完好的生物样本和防止其解体至关重要。在将 PFA 添加到冲洗的幼虫之前未完全去除 PBS 时，可能会出现 4% PFA 溶?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢犹他大学的Maurine Hobbs和集中的斑马鱼动物资源（CZAR），他们提供了斑马鱼的饲养、实验室空间和设备，以开展部分研究。国家卫生研究院拨款 #1G20OD018369-01 部分支持 CZAR 的扩展。我们还要感谢罗德尼·斯图尔特、克洛伊·林、兰斯·格雷厄姆、科迪·詹姆斯、加勒特·尼克姆以及亨茨曼癌症研究所（HCI）斑马鱼护理设施。我们要感谢肯尼思·康帕斯在研发方面的帮助。这项工作的部分资金来自亨茨曼癌症基金会的赠款（连同授予亨茨曼癌症研究所P30 CA042014的赠款）和NIH/NCI R01CA222570（KJE）。
Materials
| Camera for dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Fine (Dumont #5) forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Glass pipets | VWR | 14672-608 | |
| Image analysis software | Image J/FIJI | ImageJ/FIJI can be dowloaded for free: https://imagej.net/Welcome | |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phosphate-buffered saline | Various suppliers | ||
| Pipette pump | VWR | 53502-233 | |
| Plastic Petri dishes | USA Scientific Inc | 2906 | |
| Pyrex 9-well round-bottom glass dish | VWR | 89090-482 | |
| Software for blinding files | R project | R can be downloaded for free: https://www.r-project.org/ | |
| Scientific graphing and statistics software | GraphPad Prism | ||
| Spreadsheet program | Microsoft Excel | ||
| Tricaine methanesulfonate (Tricaine-S) | Western Chemical | 200-226 | |
| Very fine (Dumont #55) forceps | Fine Science Tools | 11255-20 |
References
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