Summary

Genetiği Değiştirilmiş Farelerin Yüksek Verimli Üretimi için Dondurulmuş Çözülmüş Embriyoların Kullanımı

Published: April 02, 2020
doi:

Summary

Burada, tek hücreli embriyoların kriyopreservation için değiştirilmiş bir yöntem yanı sıra genetik olarak değiştirilmiş farelerin verimli nesil için dondurulmuş çözülmüş embriyolar ve elektroporasyon kullanarak çiftler bir protokol sıyoruz.

Abstract

Genetiği değiştirilmiş (GM) farelerin kullanımı gen fonksiyonunu anlamak ve insan hastalıklarının altında yatan mekanizmaları çözmek için çok önemli hale gelmiştir. CRISPR/Cas9 sistemi, araştırmacıların genomu eşi görülmemiş verimlilik, sadakat ve basitlikle değiştirmelerine olanak tanır. Bu teknolojiden yararlanarak, araştırmacılar GM fareler üretmek için hızlı, verimli ve kolay bir protokol arıyorlar. Burada, dondurulan çözülmüş embriyoların daha yüksek gelişimsel oranına yol açan tek hücreli embriyoların kriyopreservation için geliştirilmiş bir yöntem sıyoruz. Optimize elektroporasyon koşulları ile birleştirerek, bu protokol kısa bir süre içinde yüksek verimlilik ve düşük mozaik oranları ile nakavt ve knock-in farelerin üretimi için izin verir. Ayrıca, CRISPR reaktif hazırlama, in vitro fertilizasyon, kriyopreservation ve tek hücreli embriyoların çözülmesi, CRISPR reaktiflerinin elektroporasyonu, fare üretimi ve kurucuların genotiplemesini kapsayan optimize edilmiş protokolümüzün adım adım açıklamasını gösteriyoruz. Bu protokolü kullanarak, araştırmacılar benzersiz bir kolaylık, hız ve verimlilik ile GM fareler hazırlamak gerekir.

Introduction

Kümelenmiş düzenli olarak uzaydan kısa palindromik tekrarlar (CRISPR)/CRISPR ilişkili protein 9 (Cas9) sistemi genom1’debenzeri görülmemiş hedefli modifikasyon sağlayan bilimsel bir atılımdır. CRISPR/Cas9 sistemi Cas9 proteinve kılavuz RNA (gRNA) iki moleküler bileşenden oluşur: hedefe özel CRISPR RNA (crRNA) ve trans-aktive CRISPR RNA (tracrRNA)2. Bir gRNA, Cas9 proteinini genomdaki spesifik lokusa, crRNA’ya bitişik 20 nükleotite ve protospacer bitişik motifine (PAM) yönlendirir. Cas9 proteini hedef sıraya bağlanır ve hatayatkın olmayan homolog uç birleştirme (NHEJ) veya yüksek sadakat homoloji yönelimli onarım (HDR)3,4,5tarafından onarılır çift iplikçikli sonları (DSBs) indükler. NHEJ eklemelere veya/ve silmelere (indels) ve dolayısıyla bir kodlama dizisi hedeflendiğinde gen kaybına yol açar. HDR homoloji dizileri içeren bir onarım şablonu varlığında hassas genom düzenleme yol açar3,4,5. NHEJ ve HDR sırasıyla nakavt ve nakavt fareler üretmek için harnessed edilmiştir.

CRISPR/Cas9 sistemi olağanüstü etkinlik ve sadakatle GM farelerinin neslini belirgin bir şekilde hızlandırmış olsa da, bu yöntemleri uygulayan bilim adamları genellikle teknik zorluklarla karşılaşır. İlk olarak, konvansiyonel protokoller döllenmişyumurta6,7pronükleus içine CRISPR düzenleme araçları tanıtmak için mikroenjeksiyon gerektirir. Bu teknik zaman alıcıdır ve genellikle kapsamlı bir eğitim gerektirir. Böylece, çeşitli gruplar elektroporasyon8ilemikroenjeksiyon yerine 8 ,9,10,11,12,13. Ancak, erken elektroporasyon protokollerinde elektroporasyon için taze embriyolar kullanılmıştır. Her deney den önce taze embriyo hazırlama zor olduğu için bu, başka bir soruna nedenoldu 14.

Son zamanlarda biz ve diğerleri gmfarelerinüretimini kolaylaştıran genom düzenleme için dondurulmuş çözülmüş embriyolar ve elektroporasyon kullanımı kombine ettik15 ,16. Bu protokol, gelişmiş embriyo manipülasyon becerileri olmadan araştırmacıların hızla yüksek verimlilik ile insan hastalıklarının hayvan modelleri oluşturmak için olanak sağlar. Protokol aynı zamanda önemli ölçüde kurucuları16genetik heterojenlik gibi GM fareler, üreten pratik zorlukları azaltır. Mozaiğiaşmak için, embriyo erimesinden sonra 1 saat içinde CRISPR reaktiflerinin elektroporasyonunu gerçekleştiriyoruz ve düzenlemenin genomun ilk replikasyonundan önce gerçekleşmesini sağlıyoruz. Başka bir gelişme istenmeyen mozaikazaltmak için Cas9 mRNA yerine Cas9 protein kullanımı içerir17. Ayrıca, tek hücreli embriyo kriyopreservation için optimal bir yöntem geliştirdik bu iki hücreli evre için gelişim hızını artırır16: fetal sığır serumu kullanımı (FBS) önemli ölçüde döllenme sonrası donma çözülmüş oositlerin hayatta kalma artırır, belki de donma çözülmüş unfertilized oositler daha esnek kılan aynı mekanizma ile18.

Burada tek hücreli C57BL/6J embriyoların kriyopreservation için modifiye yöntemi de dahil olmak üzere, dondurulmuş çözülmüş embriyolar kullanarak GM farelerin üretimi için kapsamlı bir protokol sıyoruz. Bu içerir 1) gRNA tasarım, CRISPR reaktif hazırlama ve montaj; 2) TEK hücreli embriyoların ivf, kriyoprezervasyon ve erime; 3) CRISPR reaktiflerinin dondurulmuş embriyolara elektroporasyonu; 4) Embriyo transferi sözde hamile dişi farelerin oviduct içine; ve 5) F0’nin kurucu hayvanlarının genotipleme ve dizi analizi.

Protocol

Bu çalışmada yapılan tüm hayvan bakımı ve işlemleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi’nin kural ve yönetmeliklerine göre gerçekleştirilmiştir. Deneysel protokol Toyama Üniversitesi, Tokyo Üniversitesi, Jichi Üniversitesi ve Max Planck Florida Nörobilim Enstitüsü Laboratuvar Hayvanları Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylandı. Tüm reaktifler hakkında bilgiler Malzeme Tablosu’ndagösterilmiştir. 1. CRISPR reaktif tasarımı…

Representative Results

10 dk için FBS içeren HTF’de kuluçka dahil olmak üzere tek hücreli embriyoların kriyopreservation için modifiye yöntemimiz ve ardından 1 M DMSO ve DAP213 çözeltisinde kriyopreservation, dondurulan çözülmüş embriyoların gelişim hızını iki hücreli evreye iyileştirmiştir(Şekil 1, p = 0.009, Öğrencinin t-testi). Dondurulan çözülmüş embriyolar GM farelerin üretimi için kullanıldı ve elektroporasyon koşulları optimize edildi: Protokol bölümünde açıkla…

Discussion

Açıklanan protokol, yüksek verimlilik ve düşük mozaik oranlarıile GM farelerin üretimine olanak sağlar(Tablo 1). Gelişmiş embriyo manipülasyon becerileri olmadan araştırmacıların mutant fareleri kolayca yaratmalarını sağlar, çünkü hem üreme mühendisliği hem de genom düzenleme teknolojilerinde en son ve en yararlı gelişmelerden yararlanır: CRISPR/Cas9 ribonükleoprotein (RNP) ve dondurulmuş çözülmüş embriyolara elektroporasyon. Bu gelişmeler GM farelerin neslini kolayla…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Hitomi Sawada ve Elizabeth Garcia’ya hayvan bakımı için teşekkür ederiz. Bu çalışma KAKENHI (15K20134, 17K11222, 16H06276 ve 16K01946) ve Hokugin Research Grant (H.N.’ye) ve Jichi Medical University Genç Araştırmacı Ödülü (H.U.’ya) tarafından desteklenmiştir. Otsuka Toshimi Burs Vakfı, Yüksek Angeles’ı destekledi.

Materials

0.25 M Sucrose ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) SUCROSE
1 M DMSO ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) 1M DMSO
Butorphanol Meiji Seika Pharma Co., Ltd. (Tokyo, Japan) Vetorphale 5mg
Cas9 protein: Alt-R® S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) 1081060
C57BL/6J mice Japan SLC (Hamamatsu, Japan) N/A
DAP213 ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) DAP213
FBS Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) ES-009-C
hCG MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD (Tokyo, Japan) HCG Mochida 3000
HTF ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) HTF
ICR mice Japan SLC (Hamamatsu, Japan) N/A
Isoflurane Petterson Vet Supply, Inc. (Greeley, CO) 07-893-1389
KSOM ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) KSOM
LN2 Tank Chart Industries (Ball Ground, GA) XC 34/18
M2 ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) M2
Medetomidine Nippon Zenyaku Kogyo Co.,Ltd. (Koriyama, Japan) 1124401A1060
Microscope Nikon Co. (Tokyo, Japan) SMZ745T
Midazolam Sandoz K.K. (Tokyo, Japan) 1124401A1060
Nuclease free buffer Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) 1072570
Nucleospin DNA extraction kit Takara Bio Inc (Kusatsu, Japan) 740952 .5
One-hole slide glass Matsunami Glass Ind., Ltd. (Kishiwada, Japan) S339929
One-step type Electroporator BEX Co., Ltd. (Tokyo, Japan) CUY21EDIT II
Paraffin Liquid NACALAI TESQUE Inc. (Kyoto, Japan) SP 26137-85
Platinum plate electrode BEX Co., Ltd. (Tokyo, Japan) LF501PT1-10, GE-101
PMSG ASKA Animal Health Co., Ltd (Tokyo, Japan) SEROTROPIN 1000
Povidone iodide Professional Disposables International, Inc. (Orangeburg, NY) C12400
Reduced-Serum Minimal Essential Medium: OptiMEM I Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) 22600134
Two-step type Electroporator Nepa Gene Co., Ltd. (Ichikawa, Japan) NEPA21

References

  1. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  2. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA – guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-822 (2012).
  3. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  4. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/VCas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  5. Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
  6. Mashiko, D., et al. Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA. Scientific Reports. 3, 3355 (2013).
  7. Yen, S. T., et al. Somatic mosaicism and allele complexity induced by CRISPR/Cas9 RNA injections in mouse zygotes. 发育生物学. 393 (1), 3-9 (2014).
  8. Kaneko, T., Mashimo, T. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS ONE. 10 (11), 1-7 (2015).
  9. Qin, W., et al. Efficient CRISPR/cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease. 遗传学. 200 (2), 423-430 (2015).
  10. Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Scientific Reports. 4, 6382 (2014).
  11. Hashimoto, M., Takemoto, T. Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing. Scientific Reports. 5, 11315 (2015).
  12. Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. F., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).
  13. Modzelewski, A. J., et al. Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology. Nature Protocols. 13 (6), 1253-1274 (2018).
  14. Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Scientific Reports. 8, 474 (2018).
  15. Nakagawa, Y., et al. Production of knockout mice by DNA microinjection of various CRISPR/Cas9 vectors into freeze-thawed fertilized oocytes. BMC Biotechnology. 15 (1), 1-10 (2015).
  16. Darwish, M., et al. Rapid and high-efficient generation of mutant mice using freeze-thawed embryos of the C57BL/6J strain. Journal of Neuroscience Methods. 317, 149-156 (2019).
  17. Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. 发育生物学. 418 (1), 1-9 (2016).
  18. Sakamoto, W., Kaneko, T., Nakagata, N. Use of frozen-thawed oocytes for efficient production of normal offspring from cryopreserved mouse spermatozoa showing low fertility. Comparative Medicine. 55 (2), 136-139 (2005).
  19. Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: Software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).
  20. Torres-Perez, R., Garcia-Martin, J. A., Montoliu, L., Oliveros, J. C., Pazos, F. WeReview: CRISPR Tools-Live Repository of Computational Tools for Assisting CRISPR/Cas Experiments. 生物工程. 6 (3), 63 (2019).
  21. Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs. Scientific Reports. 9, 4811 (2019).
  22. Takeo, T., Nakagata, N. Superovulation using the combined administration of inhibin antiserum and equine chorionic gonadotropin increases the number of ovulated oocytes in C57BL/6 female mice. PLoS ONE. 10 (5), 1-11 (2015).
  23. Wuri, L., Agca, C., Agca, Y. Euthanasia via CO2 inhalation causes premature cortical granule exocytosis in mouse oocytes and influences in vitro fertilization and embryo development. Molecular Reproduction and Development. 86 (7), 825-834 (2019).
  24. Nakagata, N. High survival rate of unfertilized mouse oocytes after vitrification. Journal of Reproduction and Fertility. 87 (2), 479-483 (1989).
  25. Dehairs, J., Talebi, A., Cherifi, Y., Swinnen, J. V. CRISP-ID: Decoding CRISPR mediated indels by Sanger sequencing. Scientific Reports. 6, 28973 (2016).
  26. Nakagawa, Y., Sakuma, T., Takeo, T., Nakagata, N., Yamamoto, T. Electroporation-mediated genome editing in vitrified/warmed mouse zygotes created by ivf via ultra-superovulation. Experimental Animals. 67 (4), 535-543 (2018).
  27. Nakajima, K., Nakajima, T., Takase, M., Yaoita, Y. Generation of albino Xenopus tropicalis using zinc-finger nucleases. Development Growth and Differentiation. 54 (9), 777-784 (2012).
  28. Hur, J. K., et al. Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology. 34, 807-808 (2016).
  29. Dumeau, C. E., et al. Introducing gene deletions by mouse zygote electroporation of Cas12a/Cpf1. Transgenic Research. 28 (5-6), 525-535 (2019).
  30. Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient Generation of Knockin Mice by CRISPR RNP Electroporation and AAV Donor Infection. Cell Reports. 27 (13), 3780-3789 (2019).
  31. Mizuno, N., et al. Intra-embryo Gene Cassette Knockin by CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing with Adeno-Associated Viral Vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
  32. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly Efficient RNA-guide genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  33. Vakulskas, C. A., et al. A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).
  34. Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. Distinct Roles of RZZ and Bub1-KNL1 in Mitotic Checkpoint Signaling and Kinetochore Expansion. Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).
  35. Smits, A. H., et al. Biological Plasticity Rescues Target Activity in CRISPR Knockouts. Nature Methods. 16, 1087-1093 (2019).

Play Video

Cite This Article
Nishizono, H., Darwish, M., Uosaki, H., Masuyama, N., Seki, M., Abe, H., Yachie, N., Yasuda, R. Use of Freeze-thawed Embryos for High-efficiency Production of Genetically Modified Mice. J. Vis. Exp. (158), e60808, doi:10.3791/60808 (2020).

View Video