تعزيز قابلية البقاء لثقافات الهيدروجيل Ex vivo 3D من Xenografts المستمدة من المريض في منصة Microfluidic Perfused
Summary
يوضح هذا البروتوكول أساليب تمكين الثقافة الموسعة في المختبر من xenografts المستمدة من المريض (PDX). خطوة واحدة يعزز القدرة على البقاء العام للثقافات العنقودية متعددة الخلايا في الهيدروجيل ثلاثية الأبعاد، من خلال إزالة مباشرة من الخلايا الفردية غير قابلة للحياة. خطوة ثانوية توضح أفضل الممارسات لثقافة PDX في منصة microfluidic perfused.
Abstract
xenografts المستمدة من المريض (PDX) ، التي تم إنشاؤها عندما يتم نقش أنسجة ورم المريض مُجَذَّبًا مباشرةً إلى فئران مُنَاعِدة ، تظل مستقرة بيولوجيًا ، وبالتالي الحفاظ على الميزات الجزيئية والوراثية والهظرية ، وكذلك عدم تجانس الورم الأصلي. ومع ذلك ، فإن استخدام هذه النماذج لإجراء العديد من التجارب ، بما في ذلك فحص المخدرات ، هو أمر باهظ سواء من حيث التكلفة والوقت. تُنظر إلى أنظمة الاستزراع ثلاثي الأبعاد على نطاق واسع على أنها منصات تحتفظ فيها الخلايا السرطانية بسلامتها البيولوجية من خلال التفاعلات الكيميائية الحيوية، والمورفولوجيا، والهندسة المعمارية. فريقنا لديه خبرة واسعة في زراعة خلايا PDX في المختبر باستخدام مصفوفات ثلاثية الأبعاد مكونة من حمض الهيالورونيكس (HA). من أجل فصل الخلايا الليفية الليفية الماوس الخلايا الضموية المرتبطة PDXs، ونحن نستخدم ثقافة التناوب، حيث الخلايا القوية تلتزم سطح الأنسجة ثقافة معالجة لوحات بينما خلايا الورم PDX تفكك تعويم والنفس المنتسبين في مجموعات متعددة الخلايا. تطفو أيضا في عظمى هي واحدة، وخلايا ميتة في كثير من الأحيان، والتي تشكل تحديا في جمع مجموعات PDX قابلة للحياة لتغليف المصب في الهيدروجيلز لثقافة الخلية 3D. من أجل فصل هذه الخلايا الفردية من مجموعات الخلايا الحية، لدينا استخدام كثافة الخطوة الطرد المركزي. البروتوكول الموصوف هنا يسمح باستنفاد الخلايا الفردية غير القابلة للحياة من السكان الأصحاء من مجموعات الخلايا التي سيتم استخدامها لمزيد من التجارب في المختبر. في دراساتنا، ونحن دمج الثقافات 3D في لوحات microfluidic التي تسمح لضخ وسائل الإعلام أثناء الثقافة. بعد تقييم الثقافات الناتجة باستخدام مقايسة قابلة للتطبيق تستند إلى الصور الفلورية للخلايا النقية مقابل الخلايا غير النقية ، تظهر نتائجنا أن خطوة الفصل الإضافية هذه خفضت بشكل كبير عدد الخلايا غير القابلة للحياة من ثقافاتنا.
Introduction
على مدى العقد الماضي، وقد أظهرت مجال أبحاث السرطان الحماس المتجدد لxenografts المستمدة من المريض (PDXs) كأداة لتقييم الاعتماد على مسار الخلايا السرطانية وحساسية المخدرات1. يتم تأسيس نماذج PDX الأكثر شيوعًا عن طريق زراعة الخلايا السرطانية البشرية تحت الجلد أو العظام — وهي جزء من الورم ، أو مجموعة من الخلايا المتفرعة عن الورم المنفصلة ، أو عينة من الخلايا السرطانية المنتشرة المعزولة (CTCs) – في مضيف القوارض. إذا كان الورم “اتخاذ” ناجحا، سوف تتكاثر خلايا xenograft، والأوعية الدموية، والتفاعل خلاف ذلك مع الأنسجة المضيفة لخلق ورم، والتي يمكن حصادها في الحجم الأمثل، وتقسيمها، وإعادة زرعها في المضيفين الآخرين. من بين مزاياها العديدة كنظام نموذجي ، تحتفظ PDXs عادة بجزء كبير من عدم تجانس خلايا الورم الأصلية وتمكن من تقييم المسارات البشرية الخاصة واستجابات الخلايا2،3. في سياق vivo تمكن التفاعل الورم مع الأوعية الدموية وغيرها من السترمة المجاورة وتلخص خصائص الأنسجة مثل ديناميات انتشار المخدرات، والتوتر الأكسجين، وتأثير المصفوفة خارج الخلية التي تؤثر بيولوجيا وميكانيكيا تطور الورم. الجانب السلبي من PDXs هو اعتمادها على مضيف القوارض ، سواء لتوسيع الورم وفي نهاية المطاف لاختبار الفرضية. لأن العديد من PDXs لا يمكن أن تتكيف مع الثقافة التقليدية ثنائية الأبعاد (2D) على زراعة الأنسجة البوليسترين دون أن تفقد العديد من خصائصها المرغوبة ، كان هناك الحد الأدنى من الأرضية الوسطى للباحثين بين هذه الطريقة التي تسيطر عليها نسبيا في المختبر ، والزيادة الكبيرة في النفقات والمرافق ومتطلبات الوقت لاستخدام في الطب البصري PDX.
لقد وصفنا نماذج متعددة في المختبر التي تنفذ ثقافة الخلايا 3D داخل مصفوفة داعمة، وتوسعت مؤخرا أن العمل لإثبات ثقافة الجسم الحي السابق من سرطان البروستاتا متعددة (PCa) المشتقة PDXs، سواء وحدها وفي الثقافة المشتركة مع الخلايا الليفية المشتقة من نخاع العظم4،5. حمض الهيالوروني (HA) القائم على المصفوفات hydrogel توفير الدعم للتخصيص والبيولوجيا ذات الصلة لكلا النوعين الخلية، مع السيطرة السهل على خصائص هيدروجيل والوضوح البصري للتصوير من خلال عمق هيدروجيل6.
أنسجة الورم PDX ناضجة تضم خليط متغير من الخلايا السرطانية البشرية غير متجانسة والماوس ستروما (الخلايا الليفية، والخلايا البطانية، الخ). لدراسة مساهمات محددة من نوع الخلية في تطور الورم في المختبر ، يمكن أن يكون من المفيد فصل الأورام ، وفصل مجموعات الخلايا ، ودمجها تجريبيًا بطريقة منظمة لتشريح مسارات التواصل بين الخلايا. مجموعات الخلايا المختلطة داخل هضم الأنسجة لديها توافق التفاضلية مع ظروف ثقافة محددة. على سبيل المثال، يستلزم قابلية البقاء الليفية المرتبطة بالورم إما الالتزام السطحي أو مصفوفات ثلاثية الأبعاد وظيفية مع أربطة integrin، في حين أن خلايا PDX المشتقة من الظهارية لا تحتوي عادة على هذه المتطلبات، بدلاً من ذلك تفضل تفاعلات الخلايا الخلية. يمكن استغلال هذه الاختلافات لتحقيق فصل فعال من خلايا PDX من الخلايا الماوس اللوّث stromal. تسمح ثقافة الدوران في هضم الأنسجة بتمسك الخلايا الضمية بسطح ثقافة الأنسجة بينما تدفع التصاقات الخلايا الخلوية خلايا PDX العائمة فوق سطح الثقافة الدوارة لتشكيل مجموعات متعددة الخلايا في المابير في 24−48 ساعة. وتختلف الخصائص المحددة لهذه المجموعات مع PDX (مثل، مجموعات كبيرة، ضيقة، كروية للغاية أو مجاميع أصغر وفكها تشبه عناقيد العنب)، ولكنها عادة ما تكون ذات أحجام ذات صلة بيولوجيا (قطر 50-250 ميكرومتر)، كافية لتقييم التفاعلات الخلوية التي تعتمد على الاتصالات بين الخلايا.
يؤدي استرجاع الورم ومعالجته إلى درجة ما من موت الخلايا الجانبية، إما بسبب الأضرار قصيرة الأجل الناجمة عن الاضطراب الميكانيكي/الأنزيمي، أو عدم التوافق على المدى الطويل بين السكان الفرعيين وظروف الثقافة المختارة. على الرغم من فائدة ثقافة التناوب كفصل كبير أولي ، يتم نقل الخلايا الميتة أو المحتضرة لا محالة مع مجموعات PDX ويمكن أن تؤثر على الثقافة الناتجة. هذه الخلايا الميتة غالباً ما تكون خلايا PDX الفردية التي لم يتم دمجها في كتلة، الماوس الخلايا الليفية الليفية الليفية الضمائية التي لا يمكن البقاء على قيد الحياة في ظروف الثقافة المحددة، أو خلايا بطانة الرحم الهشة بشكل خاص. ويمكن لهذه الخلايا المحتضرة أن تؤثر على النتائج التجريبية من “الناجين” ويمكن أن تؤثر بشكل كبير على القياس الكمي، على سبيل المثال، عن طريق مقايسات فحص قابلية البقاء القائمة على الصور الفلورية. لتحسين اختيار خلايا PDX الحية من هذه الطريقة، قمنا بتكييف طرق الطرد المركزي مع خطوات الكثافة لإزالة الخلايا الميتة /المحتضرة الفردية بسهولة من مخاليط PDX والاحتفاظ بمجموعات متعددة الخلايا حية في الغالب.
لتعزيز دراسة الناتجة PDX المستمدة من المجموعات في الثقافة 3D، استخدمنا منصة ثقافة الضخ microfluidics القائم على، OrganoPlate (الشكل 1)، وهو جهاز عالية الإنتاجية على رقاقة منصة تسمح للثقافة في وقت واحد تصل إلى 96 الفردية الم perfused ، 3D الثقافات على 384 جيدا microtiter لوحة القاعدة(الشكل 1A)7،8. في لوحة microfluidic 2 حارة، يتم توصيل شريحة نسيج واحد من قبل اثنين من القنوات microfluidic(الشكل 1B، هلام قناة: الأحمر، قناة التسريب: الأزرق) التي تمتد أربعة آبار في صف واحد. يتم فصل القناتين microfluidic من قبل سلسلة من البلاستيك قصيرة تسمى Phaseguide الذي يمنع تجاوز قناة واحدة في قناة جارتها المجاورة ، ويسمح في وقت واحد لواجهة خالية من الغشاء بين محتويات هلام و perfusion قناة9. لأن الجزء السفلي من لوحة microfluidic يتكون من الزجاج المجهر الصف، يمكن الاطلاع على الثقافات في نافذة المراقبة من خلال الجزء السفلي من لوحة مع مجهر قياسي أو الآلي. يتم تأسيس Perfusion في لوحة microfluidic مع الروك برمجة، وذلك باستخدام الجاذبية لدفع وسائل الإعلام من خلال قنوات microfluidic، بين آبار الخزان (الشكل 1C). يحاكي تدفق القذف بشكل أدق يلخص البيئة الدقيقة للورم من الثقافة الساكنة ، مما يسمح بدمج إجهاد القص وتعزيز توزيع الغازات والمواد المغذية. وقد سبق وصف فوائد الحفاظ على ثقافة الخلايا السرطانية الم PERFUSED في لوحة microfluidic كما أظهرت الثقافات سرطان الثدي perfused القدرة على البقاء الأمثل بالمقارنة مع ثقافة 3D ثابت من نفس الخلايا7.
ويصف هذا التقرير طريقة للانفروج المركزي للكثافة المكيفة لعزل مجموعات PDX الحية متعددة الخلايا، ويبين فائدتها في إنشاء ثقافات PDX ثلاثية الأبعاد داخل ألواح الفلورويديك القابلة للانحلال. ونظرًا لأن عددًا متزايدًا من مختبرات الأبحاث يبحث عن طرق لتسهيل استخدام PDX ، فإننا نتوقع أن تكون البروتوكولات المعروضة هنا ذات فائدة فورية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا نحن وصف طريقة لمعالجة واستزراع خلايا الورم القابلة للحياة PDX المستمدة في نظام ثقافة 3D عالية الإنتاجية. في حين أن هذا البروتوكول يستخدم أنسجة PCa PDX ، فهو فعال بنفس القدر للأورام الأخرى المشتقة من الظهارية. تختلف خصائص الورم بين خطوط PDX الفردية حتى داخل نفس النسيج الأصلي (البروستاتا والثد?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة الوطنية للسرطان المرحلة الأولى SBIR (HHSN26120700015C) وP01CA098912.
Materials
| 1N NaOH | any suitable tissue culture grade | ||
| 60 mm round tissue culture dishes | any suitable | ||
| 6-well tissue culture plates | any suitable | ||
| 70 µm cell strainers | Corning | 431751 | or equivalent |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes | or equivalent |
| Density gradient centrifugation solution | Millipore Sigma | P1644 | Percoll |
| Dimethylsulfoxide | any suitable tissue culture grade | ||
| Dissociation enzyme solution | StemCell Technologies | 07921 | ACCUMAX |
| DMEM-F12 | ThermoFisher Scientific | 11039021 | or equivalent |
| Forceps | any suitable | ||
| HA hydrogel kit | ESI BIO | GS311 | HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA) |
| Hanks Balanced Salt Solution | Lonza | 10-527F | or equivalent |
| Heat-inactivated fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B Hausser BrightLine | or equivalent |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H1398 | or equivalent |
| Image processing software | Oxford Instruments | Imaris 9.3 | or equivalent |
| LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1) | ThermoFisher Scientific | L3224 | or equivalent |
| Microfluidic culture plate | Mimetas | 9603-400-B | 2-lane OrganoPlate |
| Microscope | Nikon | A1R | or equivalent |
| Multichannel pipette | Eppendorf | 3125000036 | or equivalent |
| PDX-derived tumor tissue | obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host | ||
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | or equivalent |
| Perfusion rocker | Mimetas | OrganoPlate Perfusion Rocker Mini | |
| pH strips (pH 5-9) | any suitable | ||
| Phosphate-buffered saline solution | Lonza | 17-516F | or equivalent |
| Razor blades | any suitable | ||
| Rotating xy-shaker | VWR | Advanced 3500 Orbital Shaker | or equivalent |
| Scalpel handle | any suitable | ||
| Single channel repeating pipette | Eppendorf | 22260201 | |
| Sterile, 15mL conical centrifuge tubes | any suitable | ||
| Sterile, 50mL conical centrifuge tubes | any suitable |
References
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research. Cancer Research and Treatment: Official Journal of Korean Cancer Association. 50 (1), 1-10 (2018).
- Malaney, P., Nicosia, S. V., Dave, V. One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy. Cancer Letters. 344 (1), 1-12 (2014).
- Meehan, T. F., et al. PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models. 癌症研究. 77 (21), 62-66 (2017).
- Fong, E. L. S., et al. Hydrogel-Based 3D Model of Patient-Derived Prostate Xenograft Tumors Suitable for Drug Screening. Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2040-2050 (2014).
- Fong, E. L. S., et al. A 3D in vitro model of patient-derived prostate cancer xenograft for controlled interrogation of in vivo tumor-stromal interactions. Biomaterials. 77, 164-172 (2016).
- Engel, B. J., et al. Hyaluronic Acid-Based Hydrogel Formulations Suitable for Automated 3D High Throughput Drug Screening of Cancer-Stromal Cell Cocultures. Advanced Healthcare Materials. 4 (11), 1664-1674 (2015).
- Lanz, H. L., et al. Therapy response testing of breast cancer in a 3D high-throughput perfused microfluidic platform. BMC Cancer. 17 (1), 709 (2017).
- Wevers, N. R., et al. High-throughput compound evaluation on 3D networks of neurons and glia in a microfluidic platform. Scientific Reports. 6, 38856 (2016).
- Vulto, P., et al. Phaseguides: a paradigm shift in microfluidic priming and emptying. Lab on a Chip. 11 (9), 1596-1602 (2011).
- Patru, C., et al. CD133, CD15/SSEA-1, CD34 or side populations do not resume tumor-initiating properties of long-term cultured cancer stem cells from human malignant glio-neuronal tumors. BMC Cancer. 10, 66 (2010).
- Harma, V., et al. A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses. PLoS One. 5 (5), 10431 (2010).
