Un modello spheroid 3D per Glioblastoma

Summary

Qui, descriviamo un assaggio di invasione facile da usare per il glioblastoma. Questo test è adatto per cellule staminali del glioblastoma. Viene descritta anche una macro Fiji per una facile quantificazione dell’invasione, della migrazione e della proliferazione.

Abstract

Le colture cellulari bidimensionali (2D) non imitano la crescita del tumore in vivo in modo soddisfacente. Pertanto, sono stati sviluppati modelli di sferoidcoltura tridimensionale (3D). Questi modelli possono essere particolarmente importanti nel campo della neuro-oncologia. Infatti, i tumori cerebrali hanno la tendenza a invadere l’ambiente cerebrale sano. Descriviamo qui in un saggio ideale basato sul glioblastoma sferoide 3D che abbiamo sviluppato per studiare l’invasione tumorale. Forniamo tutti i dettagli tecnici e gli strumenti analitici per eseguire con successo questo saggio.

Introduction

Nella maggior parte degli studi che utilizzano linee cellulari primarie o disponibili in commercio, i saggi vengono eseguiti su cellule coltivate su superfici plastiche come colture monostratori. La gestione della coltura cellulare in 2D rappresenta uno svantaggio, in quanto non imita un ambiente cellulare 3D in vivo. Nelle colture 2D, l’intera superficie cellulare è direttamente in contatto con il mezzo, alterando la crescita cellulare e modificando la disponibilità di farmaci. Inoltre, la superficie plastica non fisiologica innesca la differenziazione cellulare¹. Sono stati sviluppati modelli di coltura tridimensionali per superare queste difficoltà. Hanno il vantaggio di imitare l’architettura multicellulare e l’eterogeneità dei tumori², e quindi potrebbe essere considerato un modello più rilevante per i tumori solidi³. La complessa morfologia degli sferoidi contribuisce a valutare meglio la penetrazione e la resistenza dei farmaci⁴. L’eterogeneità tumorale nello sferoide influisce sulla diffusione di ossigeno e sostanze nutritive e la risposta agli agenti farmacologici (Figura 1A). La diffusione dell’ossigeno viene alterata quando la dimensione dello sferoide raggiunge i 300 m, inducendo un ambiente ipossico al centro dello sferoide (Figura 1A,C). I metaboliti sono anche meno penetranti attraverso gli strati cellulari e compensando le reazioni metaboliche avvengono⁵. Quando il diametro dello sferoide aumenta, i nuclei necrotici possono essere osservati, imitando ulteriormente le caratteristiche che si trovano in molti tipi di cancro solido, tra cui il cancro al cervello aggressivo glioblastoma (GBM)⁶.

Diversi saggi di invasione 2D o 3D per il glioblastoma sono stati riportati nella letteratura^7,8. I saggi bidimensionali sono principalmente per studiare l’invasione in un piano orizzontale su uno strato sottile di matrice o in un assaggio della camera di Boyden⁹. I saggi tridimensionali sono stati descritti con colture di sferoidi 3D utilizzando classiche linee cellulari glioblastoma¹⁰. Varianti più complesse sono rappresentate dall’invasione degli organoidi cerebrali da parte di sferoidi tumorali nelle colture di confronto¹¹. Tuttavia, è ancora importante sviluppare un saggio facile da usare e riproducibile a disposizione di qualsiasi laboratorio. Abbiamo sviluppato un protocollo per generare cellule staminali del glioblastoma da campioni di pazienti. La quantificazione di questi saggi è facilmente gestibile e richiede solo software online ad accesso aperto. In breve, i pezzi tumorali vengono tagliati in piccoli pezzi e eviticamente digeriti. Le cellule singole derivate dalla digestione sono coltivate nel mezzo neurobasale. Dopo 4-7 giorni, le strutture sferoidi si formano spontaneamente. Al momento dell’impianto intracranico nei modelli di topi, formano tumori che presentano un nucleo necrotico circondato da cellule pseudo-palizzate¹². Questo è molto simile alle caratteristiche che si trovano nei pazienti GBM.

In questo articolo, descriviamo il nostro protocollo per produrre sferoidi da un determinato numero di cellule per garantire la riproducibilità. A questo scopo possono essere utilizzate due matrici complementari: Matrigel e collagene di tipo I. Matrigel è arricchito in fattori di crescita e imita la membrana basale dei mammiferi necessaria per l’attaccamento cellulare e la migrazione. D’altra parte, il collagene I, un elemento strutturale dello stroma, è la matrice extracellulare fibrillare più comune ed è usato nei saggi di invasione cellulare. Qui illustriamo il nostro modello di sferoide GBM eseguendo analisi su migrazione e proliferazione. L’analisi è stata effettuata non solo in momenti fissi, ma anche monitorando l’espansione degli sferoidi e il movimento cellulare mediante imaging dal vivo. Inoltre, la microscopia elettronica è stata fatta per visualizzare i dettagli morfologici.

Protocol

Il consenso scritto informato è stato ottenuto da tutti i pazienti (dall’Ospedale Haukeland, Bergen, Norvegia secondo i regolamenti del comitato etico locale). Il nostro protocollo segue le linee guida del comitato etico della ricerca umana della nostra istituzione. 1. Generazione di sferoidi tumorali di dimensioni uniformi NOTA: Le cellule staminali sono coltivate in mezzi neurobasali completati con supplemento B27, eparina, FGF-2, penicillina e streptomicina, come …

Representative Results

Gli sferoidi sono stati preparati come descritto nella sezione protocolli e sono state fatte osservazioni riguardanti la migrazione, l’invasione, la proliferazione e la microscopia. Per misurare l’ipossia in aree distinte della struttura sferica, l’colorazione iX di anidera carboxica è stata utilizzata per determinare l’attività ipossica (Figura 1A-C). Sono state osservate più cellule CAIX-positive nel centro sferoide (<strong class="xfig"…

Discussion

I saggi dello sferoide tumorale sono ben adattati per studiare le caratteristiche tumorali tra cui la proliferazione, l’invasione e la migrazione, così come la morte cellulare e la risposta ai farmaci. Le cellule tumorali invadono la matrice 3D formando un microtumore invasivo, come si vede nella Figura 4B,C. Durante il processo invasivo, matrici digeriste digeriscono matrici digerite a matrice (MMP) che circondano le cellule tumorali¹³e gli inibitor…

Materials

96 well round-bottom plate	Falcon	08-772-212
Accutase	Gibco	A11105-01	Stored at 4 °C, sphere dissociation enzyme
B27	Gibco	12587	Stored at -20 °C, defrost before use
Basic Fibroblast Growth Factor	Peprotech	100-18B	Stored at -20 °C, defrost before use
Countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10283
DPBS 10X	Pan Biotech	P04-53-500	Stored at 4 °C
Fiji software	ImageJ		Used to analyze pictures
Flask 75 cm2	Falcon	10497302
Matrigel	Corning	354230	Stored at -20 °C, diluted to a final concentration of 0.2 mg/mL in cold NBM
Methylcellulose	Sigma	M0512	Diluted in NBM for a 2% final concentration
NBM	Gibco	21103-049	Stored at 4 °C
Neurobasal medium	Gibco	21103049	Stored at 4 °C
Penicillin – Streptomycin	Gibco	15140-122	Stored at 4 °C
Trypan blue 0.4%	ThermoFisher	T10282	Used to cell counting
Type I Collagen	Corning	354236	Stored at 4 °C