本文提出了一种使用微创方法在大鼠中进行心肌缺血和随后的慢性再灌注的有效方法。此外,通过回声心动图和孤立的工作心脏方法评估大鼠左心室造影功能。
心肌梗死(MI)仍然是全世界发病率和死亡率的主要原因。因此,对本课题的研究是强制性的。需要一个容易和高度可重复的MI诱导程序,以获得进一步的洞察力和更好的理解潜在的病理变化。该程序还可用于评估急性MI、后续重塑和心力衰竭(HF)中新的和有前途的治疗(作为药物或干预)的效果或效力。在动物的插管和术前准备后,进行了异物动物的麻醉方案,并迅速进行了外科手术。使用微创方法,左前前下降动脉 (LAD) 被连接定位并阻塞。闭塞可以急性进行后续再灌注(缺血/再灌注损伤)。或者,可以永久连接容器,以调查慢性MI、重塑或HF的发展。尽管存在常见的陷阱,但辍学率很小。各种治疗,如远程缺血性调理,可以检查其心脏保护潜力前,内部和术后。手术后恢复迅速,麻醉被精确控制,手术持续时间短。术后性麻醉三天。微创手术可降低感染和炎症的风险。此外,它促进快速恢复。”工作心”测量在活体前进行,能够精确控制预载荷、后载和流量。此过程需要特定的设备和培训,以获得足够的性能。本手稿提供了进行这些测量的详细分步介绍。
虽然发病率持续下降,但急性心肌梗死(MI)仍然是造成全世界发病率和死亡率的主要原因1。在评估潜在治疗作为预防和治疗急性MI的药物或外科手术的疗效方面有限制。在人类检查其效果之前,必须提前测试这些治疗方法的风险,包括动物体内检查。没有比在体内学习病理学更好的机会了。因此,在大鼠或小鼠,甚至大型动物模型(猪或羊)中引入MI,可以调查冠状动脉和周围心肌缺血引起的短(急性)和长期(慢性)变化,以及心脏功能受损引起的系统变化。梗死大小以前是主要目标,但最近随后在急性MI或缺血/再灌注损伤以及连续心力衰竭(HF)中的心脏重塑过程变得非常令人感兴趣。因此,需要一种可比较且易于重现的方法,才能达到一致的结果。
虽然使用低温消融来获得MI已经报告2,我们的方法建立在其他研究的基础上,调查人员通过单缝结扎遮挡左前部下降动脉(LAD)。与(中)切除术程序相比,本文将介绍的微创方法允许更快的术后恢复,并显著缩短手术时间。其他外科手术的一个常见步骤是从胸腔抬起心脏进行心脏缝合3。此方法的方法使此步骤变得没有必要。根据协议,可以执行两种不同的程序:使用游环在规定时间内诱导缺血/再灌注的临时遮挡;或通过固定连结永久阻塞动脉。闭塞的成功可以通过心电图(ECG)和左心室(LV)的宏观变化及其苍白来评估。
手术前的另一个重要步骤是插管。虽然在大多数情况下,插管是通过气管切开或通过口腔插入视力下的管通过皮肤切口在喉咙,这个协议描述了麻醉动物的内切管插管,减少呼吸困难或感染术后44,55。为了避免术后并发症,在关闭胸部之前,通过注射器从胸部排出空气。
本文的第二个任务是通过一个孤立的工作心脏实验模型来评价血液动力学功能,它如何用于我们研究所66、77的其他项目。虽然超声心动图、心脏磁共振成像(MRI)和压力体积回路的侵入性定量是评估体内心脏功能的众所周知和广泛使用的方法,但已知有一些局限性。侵入性方法,如使用导管检查心脏的全球功能或特定参数,是常用的,代表了心脏测量的黄金标准。相比之下,由于心脏器械的复杂性和成本,它很少使用。有许多重要的方面,从渗透的混合物到心脏的充分罐能,这对成功评估至关重要。分离的工作心脏器械最初由奥斯卡·兰根多夫于1897年8月8日描述,近几十年来进行了9次修改。今天,有两种型号使用:朗根多夫 (LD) 模式和工作心 (WH) 模式。在我们的研究中,LD模式用于使心脏适应其新环境(约15分钟)。在这种模式下,心脏通过主动脉进行可孵性,冠状动脉经产前渗透,充分供应心肌。在 LD 模式下,心脏不执行任何压力体积工作。相比之下,在WH模式下,左中庭通过肺静脉进行缓冲,通过肺静脉使渗透进入左中庭。心脏然后泵这个渗透生理对预定义的后负荷。通过增加后载物,可以持续测量心脏功能。可以测量冠状动脉流、心脏输出 (CO)、中风体积 (SV) 和工作、心房流和 LV 收缩和舒张压力等参数。各种治疗的影响直接和单独对心脏可以调查6,6,10。廖和波德瑟9日的一篇评论介绍了该方法在评价药理作用对心脏功能和新陈代谢以及探索MI、HF、肥胖症和糖尿病等多种疾病的广泛使用。
总之,该协议提出了一种可重复的方法,用于在体内执行MI或心肌缺血/再灌注(MIR)损伤。此外,它允许在MI之后对孤立的大鼠心脏进行LV(dys-)功能的表征。该协议提出了治疗和分析的独特组合。
后MI的不良改造被认为是心力衰竭发展的关键机制。因此,为了保证心血管研究的连续性,实验程序和技术应该是可重复的。可理解且定义明确的实验协议是可重复性的基本要素。可重复性是指多个科学家可以重复并在实验室中验证的结果。这项研究旨在提出一种半微创方法,以诱导慢性或重新渗透的MI,并评估大鼠的心脏血液动力学功能。
这些结果和进一步公布的数据表明,这种手术方法具有很高的效力,在MI、改造和HF研究中的重要性。虽然缺血/再灌注损伤可用于了解MI的变化和随后的再灌注,但永久的闭塞可以进一步了解心肌的短期和长期重塑过程。其他手术方法导致更多的组织损伤,动物表现出更高的感染和肺气肿的风险,导致更高的辍学率。相反,此程序旨在通过设置和处理的具体改进来降低死亡率。此外,它们显示由于不稳定的 LAD 遮挡而纤维化疤痕扩张的变化。
我们的协议提供了一种简单的插管方法,这是整个过程最关键的步骤之一。与其他几本出版物12相比,气管切开手术在我们的过程中不进行。这增强了动物术后的觉醒和康复,导致在动物进行术后测量之前,这种手术所打算的病理生理学变化的发展。显然,如果它是非生存协议,气管切开术是在视力下进行的,因此更容易执行。此外,在生存协议中关闭气管切开术是不适用的。如果胸腔被打开,必须给肺部通风以防止崩溃。因此,大鼠在手术前插管。微创方法不会切割肋骨或胸骨,从而保持胸部的紧凑性和稳定性。因此,动物的恢复得到改善,自发性肺气肿或出血的风险相对较低。
如上所述,虽然插管具有明显的优势,但很难执行,并且可能导致在实验开始时的辍学率较高。通过培训和一些解剖学知识可以缓解这个问题。重要的是要插入管在直角和伸展动物的身体,直到光线通过声唇闪耀,然后管可以轻轻地向前推。小心不要伤害声唇,因为这可能导致肿胀,随后的粘液和窒息。
LAD 正确连接也很重要。小手术窗口、快速跳动的心脏和通风的肺(避免尽可能多接触它,因为每次接触都可能导致肺部出血),使血管无法明显可见。因此,解剖学知识是不可或缺的。左尿柱对于帮助使危险区域标准化以及围绕 LAD 定位连接是必不可少的。缝合需要在室内进行,而不是在LV中进行,因为这可能导致LV腔室直径和体积的减少,这不是由于病理过程造成的。成功的遮挡与心电图上存在风险的心肌区青紫和ST段的升高有关。此过程的主要限制是缝合的正确定位。要达到可比的结果,缝合必须在同一水平,需要使用同样量的组织。这需要高水平的训练,必须考虑动物的不同重量。需要考虑的另一点是,在闭合舱内空间之前,适当去除肺尘埃。如果不精确执行,动物将表现出呼吸困难,因为左肺的通货膨胀将受到肺气肿的阻碍。如上所述,通过使用注射器从胸部去除任何残留空气,可以减轻这种情况。
目前,这种MI程序是一种常用的方法,如果高精度地执行关键步骤,保证结果相当,存活率高。未来项目的各种治疗,设备或药物在MI,HF或心脏重塑可以通过执行这种微创技术进行评估。
如上所述,WH 测量不常使用,因为它的维护和处理需要特定的设备和知识。为了获得具有代表性和可比性的数据,必须避免陷阱。最关键的步骤是心脏的安装和从 D 模型切换到 WH 模式。如果心脏没有充分切除,安装可能很困难,因为需要足够的主动脉组织长度来固定心脏到仪器上。连接到 LD 模式后不久,心脏频率可能会因冷缓冲液的洗涤、其生理刺激在体内的断开或设备与另一物种的血液重新灌注而降低。在这种情况下,必须应用起搏器来恢复和保持生理频率。这确保了所有动物的可比结果。由于仪器内的血液体积是大鼠生理体积的倍数,因此使用Krebs-Henseleit缓冲悬浮液中的牛红血球。
从 LD 模式切换到 WH 模式是从被动心脏工作切换到主动心脏工作的同义词。LD 模式用于使心脏适应其新环境。在WH模式下,心脏必须执行其生理弹出功能。因此,在评估前需要短的适应阶段,通过增加后载量。
另一个经常被遗忘的关键步骤是仪器和渗透的充分准备和维护。必须混合每个化合物的精确体积,并且必须控制和调整系统内的温度。然而,WH是一种优雅的方法,用于同时评估心脏输出、中风体积、左心室收缩压力和冠状动脉流动。
这种诱导MI的高度可重复的过程和WH设备获取的表示数据正在证明它们本身的能力。半微创方法、LAD遮挡和插管方法有助于快速恢复和梗死尺寸的低变异性。此外,在隔离的工作心脏的心脏功能分析提供了宝贵的血液动力学结果。
The authors have nothing to disclose.
作者感谢生物医学研究中心的运营剧团和技术人员的贡献、技术援助、宝贵的意见和建议。这些项目由路德维希·博尔茨曼心血管研究集群(REM项目)资助。
ANAESTHESIA & ANALGESIA | |||
Isoflurane | Zoetis | TU061219 / 8-00487 | |
Ketamine | Dr. E. Gräub AG | 100 mg/kg of bodyweight | |
Piritramide | Hameln-Pharma Plus GmbH | 2 ampulles with 30 ml of Glucose 5% in 250ml water | |
Xylazine | Bayer | 4 mg/kg of bodyweight | |
INTUBATION | |||
Air | |||
Oxygen (pure) | |||
Ventilation machine | Hugo Sachs Electronics | UGO Basile S.R.L. | Respirator |
14-gauge tube | Dickinson and Company | BD Venflon | |
PREPARATION | |||
Anti-septic povidine iodine solution | Mundipharma | Betaisodona solution | |
Eye ointment | Fresenius Kabi Austria | Oleovital with Vitamin A + Dexpanthenol | |
Shaver | |||
SURGICAL INSTRUMENTS | |||
Anatomical forceps | Martin | 12-272-15 | |
Anatomical forceps small | Martin | 24-386-16 | |
Anatomical forceps thin | Odelga | RU4042-15 | |
Cautery Fine Tip | High Temp | bvi-Accu-Temp | |
Cup (small, for liquids) | Martin | 56-231/11 | |
Mensur | MTI | 29-260/25 | |
Mosquito clamps | MTI | 05-055/12 | |
Needleholder short | Martin | 20-658-14 | |
Needleholder thin | Martin | ||
Round hook | BT-190 | ||
Scalpell size 3 | Swann Morton | No.10, 0301 | |
Scissors for tissue preparation | Aesculap | BC259R | |
Sharp scissors | MTI | 01-010/10 | |
Small retractor | Alm | AM.416.10 | |
Surcigal forceps | Martin | 12-321-13 | |
Surgical scissors | |||
SUTURES | |||
PermaHand Silk 4-0 | Johnson & Johnson Medical Products GmbH | K891H | |
Vicryl 4-0 | Johnson & Johnson Medical Products GmbH | JV2024 | single monofil suture |
Vicryl 6-0 | Johnson & Johnson Medical Products GmbH | V301G | polyethylene suture |
COMPUTER PROGRAMS & APPARATUS | |||
Labchart 7 Pro | ADInstruments | v7.3.2 | Labchart Software |
PowerLab System | ADInstruments | Powerlab 8/30 | |
EX VIVO HEMODYNAMICS | |||
Flowmeter Narcomatic RT-500 | Narco Bio-Systems | flow probe | |
Isolated heart apparatus | Hugo Sachs Electronics | ||
Labchart 7 Pro | ADInstruments GmbH | v7.3.2 | Labchart Software |
Millar SPR-407 | Millar Instruments Inc. | 840-4079 | high-fidelity MicroTip catheter |
Needle electrodes via Animal bio Amp | ADInstruments GmbH | MLA1203 | |
Physiological Pressure Transducer (MLT844) with Clip-on BP Domes | ADInstruments GmbH | MLT844 | |
PowerLab System | ADInstruments GmbH | Powerlab 8/30 |