MeCP2 단백질 변이체에 대한 전기 화학 발광 기반 분석
Summary
전기 화학 발광 면역 분석 (ECLIA)은 내인성 및 외인성 적용 MeCP2 단백질 변이체의 정량적 검출을위한 새로운 접근법으로, 광범위한 작업 범위에 걸쳐 낮은 인트라 및 분석 오류로 높은 정량적, 정확하고 재현 가능한 측정을 생성합니다. 여기서, MeCP2-ECLIA에 대한 프로토콜을 96웰 형식으로 설명한다.
Abstract
ECLIA는 96 웰 포맷으로 내인성 및 재조합 단백질 양을 정량화할 수 있는 다목적 방법입니다. ECLIA 효율성을 입증하기 위해, 이 분석은 마우스 뇌 조직에서 MeCP2의 본질적인 수준을 분석하고 인간 진피 섬유아세포에서 TAT-MeCP2의 섭취를 분석하는 데 사용되었다. MeCP2-ECLIA는 낮은 분석 및 분석 간 오류로 매우 정확하고 재현 가능한 측정을 생성합니다. 요약하자면, 우리는 고처리량 스크린에서 이용될 수 있는 MeCP2 단백질 변이체의 평가를 위한 정량적인 방법을 개발했습니다.
Introduction
전기 화학 발광 면역 분석 (ECLIA)는 전기 화학적으로 자극 될 때 발광을 방출하도록 설계된 라벨을 활용하는 프로세스를 기반으로합니다. 그것은 임상 진단 1뿐만 아니라 기초 산업 및 학술 연구, 식품 산업에서 생물학적 분석물의 정량적 검출을 위한 광범위하게 적용 가능한기술이다. 일반적으로 탄소 잉크 전극이 있는 일회용 96웰 플레이트가 사용됩니다. 이들 전극은 면역분석에 대한 고체상 담체로서 작용한다. 이차 항체는 전기 발광 라벨에 공액되고 전기가 시스템에 가해지면 화학 라벨의 발광이 트리거됩니다. 초저잡음 전하 결합 장치(CCD)는 포획 항체에 결합된 항원과 정비례하는 광 강도를 기록하여 샘플2의표적 화된 공액을 정량화합니다. 효소 연계 면역흡착 분석(ELISA)에 비해 ECLIA는 더 높은 감도 및 재현성을 제공하며 더 나은 자동화 및 일관성3을제공함에 있어 유리한 것으로 간주됩니다.
여기서 우리는 새로 개발된 ECLIA 시스템을 사용하여 인간 및 뮤린 기원의 샘플에서 메틸-CpG 결합 단백질 2(MeCP2) 수준뿐만 아니라 재조합 단백질의 상이한 변이체를 분석하였다. MecP2는 메틸화된 DNA 서열과 상호 작용하는 것으로 알려진 X-연결된 핵산 결합 단백질입니다. 이 단백질은 유전자발현4,,5의조절에 연루되어 있다. 이 단백질을 부호 매코딩하는 유전자에 있는 기능 상실 돌연변이는 Rett 증후군 (RTT),6가혹한 신경 발달 무질서6를 일으키는 원인이 되는 주요 범인입니다. 또 다른 MeCP2 관련 장애, MECP2 중복 증후군, 또한 RTT의 그들과 겹칠 수 있는 신경 증상으로 이어질7. 특히, 여성은 주로 RTT에 의해 영향을받는 반면 남성은 주로 MECP2 중복 증후군6,,7에의해 고통받고 있습니다.
이러한 장애는 중추 신경계 (CNS)에서 각각 부족하거나 과잉 MeCP2 수준과 관련이 있습니다. 따라서, CNS에서 MeCP2 수준을 증가 포함 하는 RTT에 대 한 치료 옵션 MeCP2의 초과와 관련 된 해로운 효과 방지 해야 할 것 이다7. 이 사실로 인해 ECLIA 시스템에서 제공하는 MeCP2 단백질 수준의 매우 민감하고 정확한 정량화는 RTT의 발전과 MECP2 중복 증후군 연구에 매우 중요합니다. 인간 세포주 및 마우스 조직 샘플로부터 내인성 및 외인성 MeCP2 수준의 정밀한 측정은 인간 MeCP2 이소폼 B(또한 이소폼 e1라고도 함)로 구성된 재조합 단백질뿐만 아니라, 혈액-뇌장벽을,교차시킬 가능성이 있는 최소한의 N-말단 HIV-TAT 트랜스듀션 도메인(TAT-MeCP2)이 이 작업에서제시된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
내인성 MeCP2, 재조합 MeCP2 및 TAT-MeCP2 수준을 측정하기 위해 96 웰 플레이트 ECLIA가 개발되었습니다. MeCP2 단백질 기능의 손실은 RTT 증후군6으로이어지며, 치료는 현재 증상 관리 및 물리 치료로 제한됩니다. 1개의 유망한 처리 도로는 MeCP2 수준이 그들의 필요로 한 농도까지 적정될 수 있는 소위 단백질 대체 요법입니다12,,13,,<sup cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
브리기테 스투름 박사님께 ECLIA 악기를 지원해 주신 것에 대해 매우 감사드립니다.
Materials
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D9779 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad Laboratories Inc. | 500-0006 | Sample preperation |
| Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbit | Meso Scale Diagnostics | R32AB-1 | Antibody |
| Discovery workbench 4.0 | Meso Scale Discovery | Software | |
| DMEM (1X) | gibco by Life Technologies | 41966-029 | Sample preperation |
| Dulbecco’s PBS (sterile) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | Sample preperation, Washing solution, Coating solution |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | Extraction Buffer |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | Sample preperation |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | Extraction Buffer |
| Gold Read Buffer T (1x) with surfactant | Meso Scale Diagnostics | R92TG | MeCP2 ECLIA protocol |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| KIMBLE Dounce tissue grinder set | Sigma-Aldrich | D8938 | Sample preperation |
| Laboratory Shaker, rocking motion (low speed) | GFL | 3014 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20) | Sigma-Aldrich | M2670 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01) | Abnova Corporation | H00004204-P01 | Cell treatment |
| Microseal B seal | Bio-Rad Laboratories Inc. | MSB1001 | for plate sealing |
| Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulin | Sigma-Aldrich | M6818-100UL; RRID:AB_262075 | Antibody, Coating solution |
| MSD Blocker A | Meso Scale Diagnostics | R93BA-4 | Blocker |
| MSD SECTOR Imager 2400 | Meso Scale Diagnostics | I30AA-0 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Multi-Array 96-well Plate | Meso Scale Diagnostics | L15XB-3/L11BX-3 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Penicillin-Streptomycin | gibco by Life Technologies | 15140122 | Sample preperation |
| Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbit | Eurogentec S.A. | custom-designed | Antibody |
| Potassium chloride (KCl) | Merck KGaA | 1049361000 | Hypotonic lysis reagent |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11) | Sigma-Aldrich | SAB1404063; RRID:AB_10737296 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6) | Sigma-Aldrich | WH0004204M1; RRID:AB_1842411 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168) | Sigma-Aldrich | M6818; RRID:AB_262075 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8) | Sigma-Aldrich | M7443; RRID:AB_477235 | Antibody |
| Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3) | Cell Signaling Technology | 3456S; RRID:AB_2143849 | Antibody |
| Protease Inhibitor Cocktail (100X) | Sigma-Aldrich | 8340 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 | Eurogentec S.A. | custom | Antibody |
| Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 | Merck | 07-013 | Antibody |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | Extraction Buffer |
| SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat) | Meso Scale Diagnostics | W0015528S | Antibody |
| TAT-MeCP2 fusion protein | in-house production | Cell treatment | |
| Trypsin EDTA 0.25% (1X) | gibco by Life Technologies | 25200-056 | Cell treatment |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | Washing solution |
References
- Debad, J. D., Glezer, E. N., Wohlstadter, J., Sigal, G. B., Leland, J. K., Bard, A. J. Clinical and biological applications of ECL. Electrogenerated Chemiluminescence. , 359-383 (2004).
- Yuzaburo, N., Michinori, U., Osamu, S. Highly Sensitive Electrochemiluminescence Immunoassay Using the Ruthenium Chelate-Labeled Antibody Bound on the Magnetic Micro Beads. Analytical Sciences. 15 (11), 1087-1093 (1999).
- Liu, W., Hu, Y., Yang, Y., Hu, T., Wang, X. Comparison of two immunoassays for quantification of hepatitis B surface antigen in Chinese patients with concomitant hepatitis B surface antigen and hepatitis B surface antibodies. Archives of Virology. 160 (1), 191-198 (2015).
- Shah, R. R., Bird, A. P. MeCP2 mutations: progress towards understanding and treating Rett syndrome. Genome Medicine. 9 (1), 17 (2017).
- Chahrour, M., et al. MeCP2, a key contributor to neurological disease, activates and represses transcription. Science. 320 (5880), 1224-1229 (2008).
- Lyst, M. J., Bird, A. Rett syndrome: a complex disorder with simple roots. Nature Reviews Genetics. 16 (5), 261-275 (2015).
- Katz, D. M., et al. Rett Syndrome: Crossing the Threshold to Clinical Translation. Trends in Neurosciences. 39 (2), 100-113 (2016).
- Steinkellner, H., et al. An electrochemiluminescence based assay for quantitative detection of endogenous and exogenously applied MeCP2 protein variants. Scientific Reports. 9 (1), 7929 (2019).
- Laccone, F. A. . Synthetic MeCP2 sequence for protein substitution therapy. , (2007).
- Koutsokeras, A., Kabouridis, P. S. Secretion and uptake of TAT-fusion proteins produced by engineered mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – General Subjects. 1790 (2), 147-153 (2009).
- Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. REAP: A two minute cell fractionation method. BMC Research Notes. 3, 294 (2010).
- Xia, H., Mao, Q., Davidson, B. L. The HIV Tat protein transduction domain improves the biodistribution of beta-glucuronidase expressed from recombinant viral vectors. Nature Biotechnology. 19 (7), 640-644 (2001).
- Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
- Nagahara, H., et al. Transduction of full-length TAT fusion proteins into mammalian cells: TAT-p27Kip1 induces cell migration. Nature Medicine. 4 (12), 1449-1452 (1998).
- Trazzi, S., et al. CDKL5 protein substitution therapy rescues neurological phenotypes of a mouse model of CDKL5 disorder. Human Molecular Genetics. 27 (9), 1572-1592 (2018).
- Van Esch, H. MECP2 Duplication Syndrome. Molecular Syndromology. 2 (3-5), 128-136 (2012).
- Collins, A. L., et al. Mild overexpression of MeCP2 causes a progressive neurological disorder in mice. Human Molecular Genetics. 13 (21), 2679-2689 (2004).
- Luikenhuis, S., Giacometti, E., Beard, C. F., Jaenisch, R. Expression of MeCP2 in postmitotic neurons rescues Rett syndrome in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6033-6038 (2004).
