ניטור הישרדות וירוס שפעת מחוץ למארח באמצעות ניתוח תאים בזמן אמת
Summary
דיווח כאן הוא פרוטוקול לכימות של חלקיקים ויראליים זיהומיות באמצעות ניטור בזמן אמת של עכבה חשמלית של תאים נגועים. יישום מעשי של שיטה זו מוצג על ידי כימות שפעת A וירוס ריקבון תחת פרמטרים פיסיקוכימיים שונים המחקים תנאים סביבתיים.
Abstract
שיטות לכימות חלקיקי וירוס מייצגות היבט קריטי של מחקרים וירולוגיים רבים. למרות שקיימות מספר טכניקות אמינות, הן גוזלות זמן רב או אינן מסוגלות לזהות וריאציות קטנות. מוצג כאן פרוטוקול לכימות מדויק של טיטר ויראלי על ידי ניתוח וריאציות עכבה חשמלית של תאים נגועים בזמן אמת. עכבה תאית נמדדת באמצעות ביו-סנסורים מיקרואלקטרודים מזהב הממוקמים מתחת לתאים במיקרופלסטיק, שבהם הגודל תלוי במספר התאים, כמו גם בגודלם ובצורתם. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח בזמן אמת של התפשטות תאים, כדאיות, מורפולוגיה והגירה עם רגישות מוגברת. כמו כן מסופקת דוגמה ליישום מעשי על ידי כימות הריקבון של וירוס שפעת A (IAV) שהוגש לפרמטרים פיסיקוכימיים שונים המשפיעים על זיהום ויראלי לאורך זמן (כלומר, טמפרטורה, מליחות, pH). עבור יישומים כאלה, הפרוטוקול מפחית את עומס העבודה הדרוש תוך יצירת נתוני כימות מדויקים של חלקיקי וירוס זיהומיות. זה מאפשר השוואה של מדרונות אי-השבתה בין IAV שונים, אשר משקף את יכולתם להתמיד בסביבה נתונה. פרוטוקול זה קל לביצוע, ניתן לשחזור מאוד, והוא יכול להיות מיושם על כל וירוס המייצר אפקטים ציטופתיים בתרבית התא.
Introduction
העברת וירוס מסתמכת על שילוב של מספר גורמים. עבור וירוס המופרש בסביבה, העברתו תלויה גם ביכולת להתמיד בתנאים מחוץ למארח. לימוד אי-ההשבתה הנגיפית באופן כללי הוא, אם כן, צעד מכריע בסיוע לרשויות הבריאות הלאומיות ולקובעי המדיניות ליישם אמצעי בקרה ובטיחות ביולוגית.
הידע על התמדה בנגיף בהגדרות טבעיות ומעבדה גדל במידה ניכרת בעשור האחרון. במקרה של וירוסי שפעת A (IAV), נתיבי ההולכה שלהם מגישים חלקיקים ויראליים למגוון רחב של תנאים סביבתיים. באופן ספציפי, הם יכולים להיות מועברים באמצעות 1) מסלולים צואתיים דרך מים (כלומר, וירוסי עופות), או 2) מגע ישיר או עקיף על ידי fomites מזוהמים, כמו גם אירוסולים וטיפות נשימה (כלומר, עופות ווירוסים יונקים)1. בכל מקרה, IAV מוגשים לפרמטרים פיסיקוכימיים שונים (כלומר, pH, מליחות, טמפרטורה ולחות), אשר משפיעים פחות או יותר במהירות על הזיהום שלהם2,3,4,5,5,6,7,8,9. יש חשיבות רבה, במיוחד לגבי וירוסים זואונוטיים ומגיפה, כדי להעריך את הפוטנציאל של גורמים סביבתיים להשפיע על הדינמיקה של וירוס ואת הסיכונים של חשיפה והעברה בין מינים.
עד כה, טכניקות וירולוגיה מסורתיות (כלומר, קביעת טיטר ויראלי באמצעות בדיקות פלאק או 50% תרבות רקמות הערכת מינון זיהומיות) שימשו להערכת זיהום IAV לאורך זמן; אבל טכניקות אלה גוזלות זמן רב ודורשות אספקה רבה 10,11,12. מדידת עכבה תאים נגועים לאורך זמן עם microelectrodes משמש ככלי שימושי כדי לפקח על הישרדות IAV בתנאים סביבתיים שונים, כמו גם איון ויראלי בכלל. שיטה זו מספקת נתונים אובייקטיביים בזמן אמת המחליפים התבוננות אנושית סובייקטיבית של השפעות ציטופתיות. זה יכול לשמש כדי לקבוע את טיטר וירוס, ובכך להחליף מדידות מסורתיות עם מרווחי ביטחון נמוכים יותר והימנעות בדיקות נקודות קצה אינטנסיביות עבודה.
קיים מתאם ליניארי בין תוצאות טיטרציה המתקבלות על ידי מדידה של עכבה בתא ועל ידי בדיקת פלאק קלאסית או שיטות TCID50. לכן, נתונים המתקבלים בשיטת טיטרציה מבוססת עכבה ניתן לשנות בקלות ערכי TCID50 או pfu על ידי יצירת עקומה סטנדרטית עם דילול סדרתי של הנגיף13,14,14,15,16,17. זיהוי, כימות ויעילות של נטרול נוגדנים הנמצאים בדגימות סרום ניתן להשיג גם באמצעות גישה ניסיונית זו18,19. לאחרונה, בדיקות תאיות מבוססות עכבה שימשו כדי לסנן ולהעריך תרכובות אנטי ויראליות נגד Equid alphaherpesviruses20.
טכנולוגיה זו שימשה להערכת ההתמדה של IAVs במים מלוחים בטמפרטורות שונות וכדי לזהות מוטציות hemagglutinin של IAV להגדיל או להקטין את ההתמדה IAV בסביבה21. סינון כזה ידרוש עבודה נרחבת אם משתמשים בשיטות טיטרציה מסורתיות. עם זאת, ניתן להשתמש במתודולוגיה זו עבור כל וירוס בעל השפעה על מורפולוגיה של תאים, מספר תא ועוצמת ההתקשרות של פני התא. זה יכול לשמש גם כדי לפקח על התמדה בתנאים סביבתיים שונים (כלומר, באוויר, במים, או על משטחים).
הפרוטוקול המתואר כאן מיישם את הישרדות IAV במים כדוגמה. נגיפי שפעת אנושית נחשפים לפרמטרים פיזיקוכימיים שונים בתקופות ממושכות. מי מלוחים (35 גרם / L NaCl) בטמפרטורה של 35 °C (35 °F) נבחרו כמודל הסביבתי בהתבסס על תוצאות קודמות9. הדבקה שיורית של וירוסים חשופים מכמתת בנקודות זמן שונות באמצעות זיהום תאים. תאי MDCK, סוג תא הייחוס להגברת IAV, נזרעים על 16 לוחות מיקרוטיטר היטב מצופים בחיישני מיקרואלקטרודים ומודבקים בווירוסים חשופים 24 שעות מאוחר יותר. עכבה תאית נמדדת כל 15 דקות ומתבטאת כיחידה שרירותית הנקראת אינדקס התא (CI). השפעות ציטוטפתיות הנגרמות על ידי וירוס שפעת, שקצב הופעתו תלוי ישירות במספר החלקיקים הנגיפיים הזיהומיים המחוסנים לתרבית התאים, מוביל לירידה ב- CI, אשר לאחר מכן מכמת כערך CIT50 . ערך זה מתאים לזמן הדרוש כדי למדוד הפחתה של 50% מה- CI הראשוני (כלומר, לפני הוספת וירוס). ערכי CIT50 המחושב עבור מספר פעמים חשיפה סביבתית מאפשרים ניכוי של שיפוע ההשבתה של וירוס לאחר רגרסיה ליניארית של ערכי CIT50 .
Protocol
Representative Results
Discussion
RTCA היא טכנולוגיה מבוססת עכבה המשמשת יותר ויותר לניטור בזמן אמת של תכונות התא, כגון דבקות בתאים, התפשטות, הגירה וציטוטוקסיות. במחקר זה, היכולת של טכנולוגיה זו להעריך את הישרדות IAV מחוץ למארח מודגמת על ידי מדידת מדרון אי-השבתת וירוסים. טכניקות קפדניות כגון TCID50 ובדיקות פלאק מוחלפות על יד…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| 0.25%Trypsin | ThermoFisher | 25200056 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Falcon | 430641U | |
| E-Plate 16 (6 plates) | ACEA Biosciences, Inc | 5469830001 | E-plates are avalible in different packaging |
| FCS | Life technologies (gibco) | 10270-106 | |
| MEM 1X | Life technologies (gibco) | 31095029 | |
| PBS 1X | Life technologies (gibco) | 14040091 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies (gibco) | 11548876 | |
| TPCK-Trypsin | Worthington | LS003740 | |
| xCELLigence Real-Time Cell Analysis Instrument S16 | ACEA Biosciences, Inc | 380601310 | The xCELLigence RTCA S16 instruments are available in different formats (16-well, 96-well, single or multi-plate) |
References
- Killingley, B., Nguyen-Van-Tam, J. Routes of influenza transmission. Influenza and Other Respiratory Viruses. 7, 42-51 (2013).
- Sooryanarain, H., Elankumaran, S. Environmental Role in Influenza Virus Outbreaks. Annual Review of Animal Biosciences. 3 (1), 347-373 (2015).
- Keeler, S. P., Dalton, M. S., Cressler, A. M., Berghaus, R. D., Stallknecht, D. E. Abiotic factors affecting the persistence of avian influenza virus in surface waters of waterfowl habitats. Applied and Environmental Microbiology. 80 (9), 2910-2917 (2014).
- Stallknecht, D. E., Kearney, M. T., Shane, S. M., Zwank, P. J. Effects of pH, temperature, and salinity on persistence of avian influenza viruses in water. Avian Diseases. 34 (2), 412-418 (1990).
- Poulson, R. L., Tompkins, S. M., Berghaus, R. D., Brown, J. D., Stallknecht, D. E. Environmental Stability of Swine and Human Pandemic Influenza Viruses in Water under Variable Conditions of Temperature, Salinity, and pH. Applied and Environmental Microbiology. 82 (13), 3721-3726 (2016).
- Zhang, G., et al. Evidence of influenza A virus RNA in Siberian lake ice. Journal of Virology. 80 (24), 12229-12235 (2006).
- Nazir, J., et al. Long-Term Study on Tenacity of Avian Influenza Viruses in Water (Distilled Water, Normal Saline, and Surface Water) at Different Temperatures. Avian Diseases. 54 (1), 720-724 (2010).
- Brown, J. D., Swayne, D. E., Cooper, R. J., Burns, R. E., Stallknecht, D. E. Persistence of H5 and H7 avian influenza viruses in water. Avian Diseases. 51, 285-289 (2007).
- Dublineau, A., et al. Persistence of the 2009 pandemic influenza A (H1N1) virus in water and on non-porous surface. PLoS ONE. 6 (11), 28043 (2011).
- Titration of Influenza Viruses. Springer Nature Experiments Available from: https://experiments.springernature.com/articles/10.1007/978-1-4939-8678-1_4 (2020)
- Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. Influenza: Propagation, Quantification, and Storage. Current Protocols in Microbiology. 3 (1), 1-22 (2006).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and Plaque Assay of Influenza Virus in an Established Line of Canine Kidney Cells. Applied Microbiology. 16 (4), 588-594 (1968).
- Witkowski, P. T., et al. Cellular impedance measurement as a new tool for poxvirus titration, antibody neutralization testing and evaluation of antiviral substances. Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (1), 37-41 (2010).
- Lebourgeois, S., et al. Development of a Real-Time Cell Analysis (RTCA) Method as a Fast and Accurate Method for Detecting Infectious Particles of the Adapted Strain of Hepatitis A Virus. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 335 (2018).
- Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. Real-time cell analysis–a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity. Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).
- Fang, Y., Ye, P., Wang, X., Xu, X., Reisen, W. Real-time monitoring of flavivirus induced cytopathogenesis using cell electric impedance technology. Journal of Virological Methods. 173 (2), 251-258 (2011).
- Charretier, C., et al. Robust real-time cell analysis method for determining viral infectious titers during development of a viral vaccine production process. Journal of Virological Methods. 252, 57-64 (2018).
- Tian, D., et al. Real-Time Cell Analysis for Measuring Viral Cytopathogenesis and the Efficacy of Neutralizing Antibodies to the 2009 Influenza A (H1N1) Virus. PLoS ONE. 7 (2), 31965 (2012).
- Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. Real-time cell analysis–a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity. Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).
- Thieulent, C. J., et al. Screening and evaluation of antiviral compounds against Equid alpha-herpesviruses using an impedance-based cellular assay. Virology. 526, 105-116 (2019).
- Labadie, T., Batéjat, C., Manuguerra, J. -. C., Leclercq, I. Influenza Virus Segment Composition Influences Viral Stability in the Environment. Frontiers in Microbiology. 9, 1496 (2018).
- Wiley, D. C., Skehel, J. J. The structure and function of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus. Annual Review of Biochemistry. 56, 365-394 (1987).
