Voorbereiding van celextracten door Cryogrinding in een geautomatiseerde vriesmolen

Summary

We beschrijven een betrouwbare methode voor de bereiding van hele celextracten uit gist of andere cellen met behulp van een cryogene vriesmolen die afbraak en denaturatie van eiwitten minimaliseert. De celextracten zijn geschikt voor zuivering van functionele eiwitcomplexen, proteomische analyses, co-immunoprecipitatiestudies en detectie van labiele eiwitmodificaties.

Abstract

Het gemak van genetische manipulatie en de sterke evolutionaire instandhouding van eukaryotische cellulaire machines in de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae heeft het een vooraanstaande genetische model organisme. Aangezien een efficiënte eiwitisolatie echter afhankelijk is van een optimale verstoring van cellen, wordt het gebruik van gist voor biochemische analyse van cellulaire eiwitten belemmerd door de celwand, die duur is om enzymatisch te verteren (met behulp van lyticase of zymolyase), en moeilijk mechanisch te verstoren (met behulp van een traditionele kraalklopper, een Franse pers of een koffiemolen) zonder verwarming van monsters te veroorzaken, wat op zijn beurt eiwitdenaturatie en afbraak veroorzaakt. Hoewel het handmatig slijpen van gistcellen onder vloeibare stikstof (LN₂) met behulp van een mortel en stamper oververhitting van monsters voorkomt, is het arbeidsintensief en onderhevig aan variabiliteit in cellyse tussen operatoren. Al vele jaren bereiden we met succes gistextracten van hoge kwaliteit met cryogrinding van cellen in een geautomatiseerde vriesfabriek. De temperatuur van -196 °C bereikt met het gebruik van LN₂ beschermt het biologische materiaal tegen afbraak door proteasen en nucleases, waardoor het ophalen van intacte eiwitten, nucleïnezuren en andere macromoleculen mogelijk is. Hier beschrijven we deze techniek in detail voor ontluikende gistcellen waarbij eerst een suspensie van cellen in een lysebuffer wordt bevroren inbeslagneming in LN₂ om bevroren druppels cellen te genereren die bekend staan als “popcorn”. Deze popcorn wordt vervolgens verpulverd onder LN₂ in een vriesmolen om een bevroren “poeder” extract dat langzaam ontdooid en verduidelijkt door centrifugatie te verwijderen onoplosbare puin te genereren. De resulterende extracten zijn klaar voor downstream toepassingen, zoals eiwit- of nucleïnezuurzuivering, proteomische analyses of co-immunoprecipitatiestudies. Deze techniek is op grote schaal toepasbaar voor celextractberedeiding uit verschillende micro-organismen, planten- en dierlijk weefsels, mariene specimens, waaronder koralen, en het isoleren van DNA/RNA uit forensische en permafrostfosiele specimens.

Introduction

Gist is een populair model organisme voor eiwitstudies, want het is een eenvoudig eukaryotisch organisme met een overvloed aan genetische en biochemische hulpmiddelen beschikbaar voor onderzoekers¹. Door hun stevige celwand is een uitdaging waar onderzoekers voor staan om de cellen efficiënt te lyseren zonder de cellulaire inhoud te beschadigen. Er zijn verschillende methoden beschikbaar voor het verkrijgen van eiwitextracten door verstoring van gistcellen, waaronder enzymatische lyse (zymolyase)^2,3, chemisch lysis⁴, fysisch lyse door vries-dooi⁵, drukgebaseerd (Franse pers)^6,7, mechanisch (glazen kralen, koffiemolen)^8,9, sonicatiegebaseerde¹⁰ en cryogene^2,11. De efficiëntie van cellyse en de eiwitopbrengst kan sterk variëren afhankelijk van de gebruikte techniek, wat het eindresultaat of de geschiktheid voor de gewenste downstream-toepassing voor het lysaat beïnvloedt. Bij het bestuderen van eiwitten die instabiel zijn, vluchtige posttranslational wijzigingen hebben, of temperatuurgevoelig zijn, is het bijzonder belangrijk om een methode te gebruiken die monsterverlies of afbraak tijdens de voorbereiding minimaliseert.

Extractpreparaattechniek	Details	Voordelen	Nadelen	Downstream-analyse	Verwijzing
Franse pers: Hogedrukhomogenisator (aka Microfluidizer) met enzymatische voorbehandeling met Zymolyase	Zymolyase-20T, een Microfluidizer hogedrukhomogenisator. De disruptor bestaat uit een luchtaangedreven hogedrukpomp (verhouding 1:250; vereiste luchtdruk 0,6-l MPa) en een speciale storingskamer met een extra terugdrukeenheid. Voor de verwerking is een minimale steekproefgrootte van 20 mL vereist.	De uiteindelijke totale verstoring die werd verkregen met behulp van het gecombineerde protocol naderde 100 % met 4 passen bij een druk van 95 MPa, in vergelijking met slechts 32 % verstoring met 4 passen op 95 MPa met alleen homogenisatie zonder de Zymolyase.	Niet geschikt voor kleinschalige toepassingen. De enzymen kunnen duur worden voor grootschalige preparaten.	Eiwitzuivering	6
Kraalklopper: Zymolyase behandelde cellen met glazen kralen in een fastprep-instrument	Ongeveer een gelijk volume van koude, droge, zuur gewassen 0,5 mm glazen kralen wordt toegevoegd aan een bepaald volume van de cel pellet in lyse buffer en de cellen worden verstoord door krachtige handmatige agitatie.	Het is vooral handig bij het maken van extracten uit veel verschillende kleine gistculturen voor testdoeleinden in plaats van voor eiwitzuivering.	Tijdens de glaskraalprocedure worden eiwitten hard behandeld, waardoor uitgebreid schuimen leidt tot eiwitdenaturatie. De hoeveelheid celbreuk varieert, terwijl proteolyse en modificatie van de eiwitten het gevolg kunnen zijn van het verwarmen van het extract boven de 4°C tijdens de mechanische breuk.	Meestal DNA & RNA-analyses, maar ook eiwitanalyse door het denatureren van gelelektrofe, met of zonder westerse blotting.	8
Zymolyase behandeling gevolgd door lyse met behulp van een combinatie van osmotische shock en Dounce homogenisatie	Na enzymatische vertering van celwanden worden spheroplasten lysed met 15 tot 20 slagen van een nauwsluitende stamper (klaring 1 tot 3 μm) in een Dounce homogenisator.	Voordelig om protease-deficiënte stammen zoals BJ926 of EJ101 te gebruiken. Dit is de zachtste manier om gistcellen te breken en daarom is het het meest geschikt voor het voorbereiden van extracten die complexe enzymatische functies kunnen uitvoeren (bijvoorbeeld vertaling, transcriptie, DNA-replicatie) en waarin de integriteit van macromoleculaire structuren (bijvoorbeeld ribosomen, splicesomen) moet worden gehandhaafd. Het is ook nuttig voor het isoleren van intacte kernen die kunnen worden gebruikt voor chromatinestudies (Bloom and Carbon, 1982) of voor nucleaire eiwitextracten (Lue en Kornberg, 1987).	De belangrijkste nadelen van de spheroplast lyse procedure zijn dat het relatief vervelend en duur, vooral voor grootschalige preparaten (>10 liter), en de lange incubatieperioden kan leiden tot proteolyse of eiwit modificatie.  Voor chromatinepreparaten lijken ze van verschillende of lagere kwaliteit te zijn dan die welke door de differentiële centrifugatie worden geproduceerd (gebaseerd op nucleosoomladderintegriteit).	Het isoleren van intacte kernen voor chromatinestudies, extracten die complexe enzymatische functies kunnen uitvoeren, extracten die de integriteit van macromoleculaire structuren, nucleaire eiwitextracten.	2
Cel verstoring van flash bevroren cellen door slijpen in vloeibare stikstof met behulp van een mortier / stamper of een blender	Cellen worden onmiddellijk ingevroren in vloeibare stikstof en vervolgens lysed door handmatig slijpen in een mortel met behulp van een stamper, of met behulp van een Waring blender in de aanwezigheid van vloeibare stikstof.	Het protocol is snel en eenvoudig. Het is geschikt voor verschillende hoeveelheden gistcellen, waaronder zeer grote culturen. Het belangrijkste voordeel is dat cellen onmiddellijk uit de actief groeiende toestand in vloeibare stikstof (−196°C) worden genomen, afnemende degradatieve enzymactiviteiten zoals proteasen en nucleases, evenals activiteiten die eiwitten wijzigen (bijvoorbeeld fosforsataden en kinases). Het is bijzonder geschikt voor het maken van hele cel extracten uit een enkele gistcultuur voor grootschalige eiwitzuivering.	Een beetje rommelig en potentieel gevaarlijk voor de onzorgvuldige onderzoeker. Kleine monsters (d.w.z. 10- tot 100-ml gistculturen) worden niet gemakkelijk verwerkt omdat er niet genoeg massa bevroren celklontjes zijn om effectief in de blender te breken. Het is tijdrovend om individuele monsters te verwerken en de apparatuur tussen het gebruik door schoon te maken.	Hele cel extracten uit een enkele gistcultuur voor grootschalige eiwitzuivering.	2
Autolyse, Parelmolen	pH 5,0, 50 °C, 24 uur, 200 tpm / Ø 0,5 mm, 5 × 3 min/3 min	Snelle en efficiënte lysis, vooral voor kleinschalige extractvoorbereiding	Warmteopwekking leidt tot denaturatie en afbraak van macromoleculen. Kraal slaan apparatuur vereist.	Kleinschalige analyses.	10
Autolyse, Sonicatie	pH 5.0, 50 °C, 24 h, 200 tpm, 4 × 5 min/2 min, pulser 80%, vermogen 80%	Sonicatie apparatuur is meestal beschikbaar in de meeste instellingen.	Warmteopwekking leidt tot denaturatie en afbraak van macromoleculen. Sonicatie-apparatuur vereist. Langzaam lysis kan meer dan 24 uur duren.	Gistcelwandpreparaten.
Kokend en vriesdooiproces	Geen gespecialiseerde apparatuur nodig, andere dan een standaard vriezer en een verwarmingsblok of warmwaterbad.	Efficiënt, reproduceerbaar, eenvoudig en goedkoop.	Warmteopwekking leidt tot denaturatie en afbraak van macromoleculen.	DNA-analyses door PCR.	5

Tabel 1: Vergelijking van de beschikbare methoden voor de bereiding van gistextracten.

Cryogrinding (ook bekend als cryogene slijpen / cryogene frezen) wordt vaak gebruikt om nucleïnezuren, eiwitten of chemicaliën te halen uit temperatuurgevoelige monsters op een betrouwbare manier voor kwantitatieve of kwalitatieve analyses. Het is met succes gebruikt voor meerdere toepassingen op verschillende gebieden, waaronder biotechnologie, toxicologie, forensische wetenschap^12,13, milieuwetenschappen, plantenbiologie¹⁴ en voedingswetenschap. Isolatie van intacte biologische macromoleculen is meestal van cruciaal belang voor de temperatuur. Extreem lage temperaturen zorgen ervoor dat de proteases en nucleases inactief blijven, wat resulteert in een betrouwbare isolatie van intacte eiwitten, nucleïnezuren en andere macromoleculen voor latere analyses. Een vriesfabriek houdt meestal een monstertemperatuur van -196 °C (het kookpunt van LN_2),waardoor DNA/RNA of eiwitdenaturatie en -afbraak tot een minimalisering en afbraak worden geminimaliseerd.

De vriesmolen maakt gebruik van een elektromagnetische slijpkamer die snel een stevige metalen staaf of cilinder heen en weer beweegt in een flacon met het monster dat moet worden verpulverd tussen roestvrijstalen eindpluggen. Het instrument creëert en keert snel een magnetisch veld in de slijpkamer. Terwijl het magnetisch veld heen en weer verschuift, verplettert de magneet het monster tegen de pluggen en bereikt zo het ‘cryogrinding’ en de verpulvering van de popcorn. De vriesmolen vervangt de mortel en stamper en maakt de sequentiële verwerking van meerdere monsters (of tot 4 kleinere monsters tegelijk) met een hoge reproduceerbaarheid mogelijk en vermijdt de variabiliteit van gebruiker tot gebruiker in verband met handmatig slijpen. Zodra de monsters zijn verwerkt, kunnen de celextracten worden gebruikt voor een verscheidenheid aan downstream-toepassingen.

Protocol

1. Bereiding van gist popcorn Kweek gistcellen in 0,5 L YPD-media tot een dichtheid van 1 x 107 cellen/mL. Tel cellen met behulp van een Coulter Counter of een andere manier. Centrifugecellen gedurende 10 minuten bij 2.400 g en 4 °C. Was elk monster één keer met 500 mL ijskoud gedeïmiseerd 18 mega Ohm Milli-Q water. Resuspend pellets in 15 mL ijskoude Lyse Buffer [20 mM HEPES-KOH pH 7.5, 110 mM KCl, 0,1% Tween, 10% glycerol, met vers toegevoegde reduceermiddel 10 mM …

Representative Results

We vergeleken twee verschillende methoden voor gistcellyse, namelijk glaskraalfrezen bij 4 °C en een geautomatiseerde cryogrindingmethode bij -196 °C, om de relatieve hersteleiwitten in de celextracten te beoordelen die met beide methoden zijn bereid. Voor deze studie hebben we ervoor gekozen om een ontluikende giststam YAG 1177 te gebruiken (MAT a lys2-810 leu2-3,-112 ura3-52 his3-Δ200 trp1-1[am] ubi1-Δ1::TRP1 ubi2-Δ2::ura3 ura3 ura3ubi3-Δub-2 ubi4-Δ2::LEU2 [pUB39] [pUB221])<sup c…

Discussion

Een beperking van het bestuderen van inheemse eiwitten uit gist is de inefficiënte lyse van gistcellen als gevolg van hun taaie celwand. Hoewel verschillende methoden zijn ontwikkeld, de meest consistente en efficiënte methode in onze handen is de cryogrinding van gistcellen flash bevroren als popcorn. Deze methode maakt de betrouwbare voorbereiding van hoogwaardige hele cel extracten uit ontluikende gist in vergelijking met andere lyse methoden. De representatieve resultaten toonden aan dat cryogrinding superieur is a…

Materials

50 mL polycarbonate tubes with screw caps	Beckman	357002	Centrifuge tubes
BD Bacto Peptone	BD Biosiences	211677	Yeast YPD media component
BD Bacto Yeast Extract	BD Biosiences	212750	Yeast YPD media component
Beckman Avanti centrifuge	Beckman	B38624	High speed centrifuge
Beckman JLA-9.1000	Beckman	366754	Rotor
D-(+)-Dextrose Anhydrous	MP Biomedicals	901521	Yeast YPD media component
Eppendorf A-4-44	Eppendorf	22637461	Swinging bucket rotor
Eppendorf refrigerated centrifuge 5810 R	Eppendorf	22625101	Refrigerated centrifuge
Glycerol	SIGMA-ALDRICH	G5150-1GA	Volume excluder and cryoprotectant
HEPES	FisherBiotech	BP310-100	Buffer
HIS6 antibody	Novagen	70796	Antibody for HIS tag
KCl	SIGMA-ALDRICH	P9541-1KG	Salt for maintaining ionic strength
MG-132	CALBIOCHEM	474790	Proteasome Inhibitor
Phosphatase inhibitor cocktail	ThermoFisher Scientific	A32957	Phosphatase inhibitor cocktail
Ponceau S	SIGMA	P7170-1L	Protein Stain
Protease inhibitor cocktail	ThermoFisher Scientific	A32963	Protease inhibitor cocktail
Rotor JLA 25.500	Beckman	JLA 25.500	Rotor
Sodium Butyrate	EM Science	BX2165-1	Histone Deacetylase Inhibitor
Sodium Fluoride	Sigma-Aldrich	S6521	Phosphatase Inhibitor
Sodium Vanadate	MP Biomedicals	159664	Phosphatase Inhibitor
Sodium β-glycerophosphate	Alfa Aesar	13408-09-8	Phosphatase Inhibitor
Spex Certiprep 6850 freezer mill	SPEX Sample Prep	6850	Freezer Mill
TALON Metal Affinity Resin	BD Biosiences	635502	For pulling down HIS tagged proteins
Tween 20	VWR International	VW1521-07	Non-ionic detergent
β-Mercaptoethanol	AMRESCO	M131-250ML	Reducing agent