In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation
Summary
Aquí se presenta un protocolo para realizar la manipulación genética en el cerebro de hurón embrionario utilizando en la electroporación del útero. Este método permite la focalización de células progenitoras neuronales en el neocórtex in vivo.
Abstract
La manipulación de la expresión génica in vivo durante el desarrollo embrionario es el método de elección al analizar el papel de los genes individuales durante el desarrollo de mamíferos. En la electroporación del útero es una técnica clave para la manipulación de la expresión génica en el cerebro de mamífero embrionario in vivo. Aquí se presenta un protocolo para la electroporación del útero del neocórtex embrionario de hurones, un pequeño carnívoro. El hurón se está utilizando cada vez más como modelo para el desarrollo de neocórtex, ya que su neocórtex exhibe una serie de características anatómicas, histológicas, celulares y moleculares que también están presentes en primates humanos y no humanos, pero ausentes en modelos de roedores, como el ratón o la rata. En la electroporación del útero se realizó en el día embrionario (E) 33, una etapa de midneurogénesis en hurones. En la electroporación del útero se dirige a las células progenitoras neuronales que recubren los ventrículos laterales del cerebro. Durante la neurogénesis, estas células progenitoras dan lugar a todos los demás tipos de células neuronales. Este trabajo muestra resultados representativos y análisis en E37, día postnatal (P) 1 y P16, correspondientes a 4, 9 y 24 días después en electroporación del útero, respectivamente. En etapas anteriores, la progenie de las células dirigidas consiste principalmente en varios subtipos de progenitores neuronales, mientras que en etapas posteriores la mayoría de las células etiquetadas son neuronas postmitoticas. Así, en la electroporación del útero permite el estudio del efecto de la manipulación genética en las características celulares y moleculares de varios tipos de células neuronales. A través de su efecto en varias poblaciones celulares, en la electroporación del útero también se puede utilizar para la manipulación de características histológicas y anatómicas del neocórtex hurón. Es importante destacar que todos estos efectos son agudos y se realizan con una especificidad espaciotemporal determinada por el usuario.
Introduction
El neocórtex es la lámina exterior del cerebrum mamífero y el asiento de las funciones cognitivas superiores1,2,3,4,5. Con el fin de lograr una manipulación genética aguda en el neocórtex de mamíferos in vivo durante el desarrollo embrionario, se han explorado dos métodos diferentes: infección viral6 y electroporación del útero7. Ambos métodos permiten la focalización eficiente de las células neocorticales, pero sufren de algunas limitaciones. La principal ventaja de la electroporación del útero en comparación con la infección viral es la capacidad de lograr la especificidad espacial dentro del neocórtex, que se logra mediante la regulación de la dirección del campo eléctrico.
Dado que la electroporación se demostró por primera vez para facilitar la entrada de ADN en las células in vitro8, se ha aplicado para entregar ADN en varios vertebrados in vivo. En la neurociencia del desarrollo, en la electroporación del útero del neocórtex del ratón se notificó por primera vez en 20019,10. Este método consiste en una inyección de la mezcla de ADN en el ventrículo lateral del cerebro embrionario y posterior aplicación del campo eléctrico utilizando electrodos de pinza, lo que permite la precisión espacial7,,11. En el útero la electroporación se ha aplicado desde entonces para entregar ácidos nucleicos con el fin de manipular la expresión de genes endógenos o ectópicamente añadidos en el neocórtex del ratón. Recientemente se han realizado importantes progresos al aplicar la metodología de edición del genoma mediado por CRISPR/Cas9 a través de la electroporación del útero en el neocórtex del ratón para realizar (1) la alteración del gen en las neuronas postmitóticas12,,13 y las células progenitoras neuronales14y (2) el genoma15 y la edición del epigenoma16.
Muy poco después del primer informe en ratón, en electroporación del útero se aplicó a la rata embrionaria neocórtex17,18. Los no roedores siguieron siendo un desafío hasta que se notificó la primera electroporación del útero de hurones, un pequeño carnívoro, en 201219,,20. Desde entonces, en la electroporación del útero de hurones se ha aplicado para estudiar los mecanismos del desarrollo de neocortex mediante el etiquetado de progenitores neuronales y neuronas20,,21,22,23, manipulando la expresión de genes endógenos, incluyendo el uso de la tecnología CRISPR/Cas924,y mediante la entrega de genes ectópicos21,,22,,25, incluyendo genes específicos para el ser humano26. Además, en la electroporación del útero de hurones se ha utilizado para abordar las características del desarrollo del neocórtex humano en condiciones patológicas27,,28.
En el contexto del desarrollo de neocórtex, las ventajas de usar hurones como organismo modelo en comparación con los ratones se deben al hecho de que los hurones recapitulan mejor una serie de características similares a las humanas. A nivel anatómico, los hurones presentan un patrón característico de plegado cortical, que también está presente en humanos y la mayoría de otros primates, pero está completamente ausente en ratones o ratas4,,29,,30,,31. A nivel histológico, los hurones tienen dos zonas germinales subventriculares distintas, denominadas zonas subventriculares internas y externas (ISVZ y OSVZ, respectivamente)32,33, separadas por la capa de fibra interna23. Estas características también se comparten con los primates, incluyendo los seres humanos, pero no con los ratones34. La ISVZ y la OSVZ en hurones y humanos están pobladas con abundantes células progenitoras neuronales, mientras que la zona subventricular (SVZ) de ratones contiene sólo progenitores neuronales dispersos21,32,35,36. A nivel celular, los hurones exhiben una alta proporción de un subtipo de progenitores neuronales denominados glia radial basal o externa (bRG u oRG, respectivamente), que se consideran instrumentales para la expansión evolutiva del neocortex de mamíferos34,,37,,38. por lo tanto, bRG son muy abundantes en el neocórtex hurón humano y embrionario fetal, pero son muy raros en el ratón embrionario neocórtex35,,36. Además, el hurón bRG muestra heterogeneidad morfológica similar a la del bRG humano, muy superior al ratón bRG21. Por último, a nivel molecular, el desarrollo de hurón neocórtex muestra patrones de expresión génica muy similares a los del neocórtex humano fetal, que se presume que controlan el desarrollo de plegado cortical, entre otras cosas39.
Las características biológicas y moleculares celulares del hurón bRG las hacen altamente proliferativas, similares a la bRG humana. Esto se traduce en una mayor producción de neuronas y el desarrollo de un neocórtex ampliado y altamente complejo34. Estas características hacen que los hurones sean excelentes organismos modelo para el estudio de características similares a las humanas del desarrollo de neocórtex que no se pueden modelar en ratones26,,40. Para aprovechar al máximo el hurón como organismo modelo se desarrolló el método presentado. Consiste en la electroporación del útero de embriones hurones E33 con un plásmido que expresa la GFP (pGFP) bajo el control de un promotor ubicuo, CAG. Los embriones electroporados pueden ser analizados embrionaria o postnatal. Con el fin de reducir el número de animales sacrificados, las hurones hembra (jills) son esterilizadas por histerectomía y donadas para adopción como mascotas. Si los embriones dirigidos se cosechan en etapas embrionarias, se realiza una segunda cirugía y los embriones son extirpados por una sección cesárea, mientras que las jills se histerorectan. Si los embriones objetivo se analizan en etapas postnatales, las jills se histeroscenten después de que los cachorros han sido destetados o sacrificados. Por lo tanto, también se presenta un protocolo para la histerectomía de las jills.
Protocol
Representative Results
Discussion
En electroporación del útero en hurón es una técnica importante, con ventajas y desventajas con respecto a otros métodos. Hay pasos críticos y limitaciones para este método, así como posibles modificaciones y aplicaciones futuras a tener en cuenta.
Desde el trabajo pionero de Víctor Borrell y sus colegas en la manipulación genética del neocórtex hurones postnatal a través de la electroporación o inyección viral35,42…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los Servicios e Instalaciones del Instituto Max Planck de Biología Molecular y Genética por el excelente apoyo brindado, en particular todo el equipo de los Servicios Biomédicos (BMS) para la excelente cría de hurones y J. Peychl y su equipo de la Instalación de Microscopía Ligera. Estamos particularmente agradecidos a Katrin Reppe y Anna Pfeffer del BMS por el apoyo veterinario excepcional y a Lei Xing del grupo Huttner por ayudar con cirugías de hurones.
Materials
| 1ml syringe | BD | 309628 | Electroporation |
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | V392ZG | Surgery |
| Aluminium spray | cp-pharma | 98017 | Surgery |
| Amoxicilin+clavulanic acid (Synulox RTU) | WDT | 6301 | Surgery |
| Cappilary holder | WPI | MPH6S12 | Electroporation |
| Dexpanthenol Ointment solution | Bayer | 6029009.00.00 | Surgery |
| Drape sheet 45x75cm | Hartmann | 2513052 | Surgery |
| Electrode Tweezer, platinum plated 5mm | BTX | 45-0489 | Electroporation |
| Electroporator | BTX | ECM830 | Electroporation |
| Fast Green | Sigma | F7258-25G | Electroporation |
| Ferret Mustela putorius furo | Marshall | NA | Experimental organism |
| Fiber optic light source | Olympus | KL1500LCD | Electroporation |
| Forceps | Allgaier instrumente | 08-033-130 | Surgery |
| Forceps 3C-SA | Rubis Tech | 3C-SA | Surgery |
| Forceps 55 | Dumostar | 11295-51 | Surgery |
| Forceps 5-SA | Rubis Tech | 5-SA | Surgery |
| Gauze swabs large | Hartmann | 401723 | Surgery |
| Gauze swabs small | Hartmann | 401721 | Surgery |
| GFAP antibody | Dako | Z0334 | Antibody |
| GFP antibody | Aves labs | GFP1020 | Antibody |
| Glass cappilaries (Borosilicate glass with filament, OD:1.2mm, ID: 0.69mm, 10cm length) | Sutter Instrument | BF120-69-10 | Electroporation |
| Glucose | Bela-pharm | K4011-02 | Surgery |
| Heat pad | Hans Dinslage | Sanitas SHK18 | Surgery |
| Iodine (Betadine solution 100 mg/ml) | Meda | 997437 | Surgery |
| Isofluran | CP | 21311 | Surgery |
| Loading tips 20µl | Eppendorf | #5242 956.003 | Electroporation |
| Metamizol | WDT | 99012 | Surgery |
| Metzenbaum dissecting scissors | Aesculap | BC600R | Surgery |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-97 | Electroporation |
| pCAGGS-GFP | NA | NA | From Kalebic et al., eLife, 2018 |
| PCNA antibody | Millipore | CBL407 | Antibody |
| pH3 antibody | Abcam | ab10543 | Antibody |
| Scalpel | Aesculap | 294200104 | Surgery |
| Shaver | Braun | EP100 | Surgery |
| Sox2 antibody | R+D Systems | AF2018 | Antibody |
| Surgical clamp 13cm | WDT | 27080 | Surgery |
| Surgical double spoon (Williger) | WDT | 27232 | Surgery |
| Surgical drape | WDT | 28800 | Surgery |
| Surgical scissors small | FST | 14090-09 | Surgery |
| Suturing needle holder | Aesculap | BM149R | Surgery |
| Tbr2 antibody | Abcam | ab23345 | Antibody |
| Transfer pipette 3ml | Fischer scientific | 13439108 | Surgery |
| Water bath | Julabo | TW2 | Surgery |
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