Een verbeterd protocol om te zuiveren en direct Mono-Biotinylaat Recombinant BDNF in een tube voor cellulaire trafficking studies in neuronen
Summary
Recombinant BDNF met een Avi sequentie (BDNFAvi) wordt op een kosteneffectieve manier geproduceerd in HEK293 cellen en wordt gezuiverd door affiniteitschromatografie. BDNFavi wordt dan direct mono-biotinylated met het enzym BirA in een buis. BDNFavi en mono-biotinylated BDNFavi behouden hun biologische activiteit in vergelijking met commercieel verkrijgbaar BDNF.
Abstract
Recombinant BDNF met een Avi sequentie (BDNFAvi) wordt geproduceerd in HEK293 cellen en vervolgens kosteneffectief gezuiverd door affiniteit chromatografie. Een reproduceerbaar protocol werd ontwikkeld om direct mono-biotinylaat BDNFAvi met het enzym BirA in een buis. In deze reactie behoudt mono-biotinylated BDNFAvi zijn biologische activiteit.
Neurotrophins zijn doel-afgeleide groeifactoren die een rol spelen in neuronale ontwikkeling en onderhoud. Ze vereisen snelle transportmechanismen langs de endocytische route om lange afstand signalering tussen verschillende neuronale compartimenten mogelijk te maken. De ontwikkeling van moleculaire instrumenten om de handel in neurotrofinen te bestuderen heeft het mogelijk gemaakt om deze eiwitten nauwkeurig in de cel te volgen met behulp van in vivo-opname. In dit protocol ontwikkelden we een geoptimaliseerde en kosteneffectieve procedure voor de productie van mono-biotinylated BDNF. Een recombinant BDNF variant met een biotinelyle avi sequentie (BDNFAvi) wordt geproduceerd in HEK293 cellen in het microgram bereik en vervolgens gezuiverd in een gemakkelijk schaalbare procedure met behulp van affiniteit chromatografie. Het gezuiverde BDNF kan dan homogeen mono-biotinylated worden door een directe in vitro reactie met het enzym BirA in een buis. De biologische activiteit van de mono-biotinylated BDNF (mbtBDNF) kan worden geconjugeerd tot streptavidin-geconjugeerd aan verschillende fluoroforen. BDNFAvi en mbtBDNF behouden hun biologische activiteit die wordt aangetoond door de detectie van downstream fosforylated doelen met behulp van westelijke vlek en activering van de transcriptiefactor CREB, respectievelijk. Met behulp van streptavidin-quantum dots konden we mbtBDNF internalisatie visualiseren, gelijktijdig met activering van CREB, dat werd gedetecteerd met een fosfo-CREB specifiek antilichaam. Bovendien was mbtBDNF geconjugeerd tot streptavidin-quantum dots geschikt voor retrograde transportanalyse in corticale neuronen gekweekt in microfluïde kamers. Dus, in buis geproduceerde mbtBDNF is een betrouwbaar instrument om fysiologische signalering endosome dynamiek en de handel in neuronen te bestuderen.
Introduction
Neuronen zijn de functionele eenheden van het zenuwstelsel met een complexe en gespecialiseerde morfologie die synaptische communicatie mogelijk maakt, en dus de generatie van gecoördineerd en complex gedrag in reactie op diverse stimuli. Neuronale projecties zoals dendrieten en axonen zijn kritische structurele kenmerken die betrokken zijn bij neuronale communicatie, en neurotrofinen zijn cruciale spelers bij het bepalen van hun morfologie en functie1. Neurotrophins zijn een familie van gedetscheidste groeifactoren waaronder NGF, NT-3, NT-4 en brain-derived neurotrofische factor (BDNF)2. In het centrale zenuwstelsel (CNS) neemt BDNF deel aan diverse biologische processen, waaronder neurotransmissie, dendritische arborisatie, rijping van dendritische stekels, langdurige potentiëring, onder andere3,4. Daarom speelt BDNF een cruciale rol bij het reguleren van de neuronale functie.
Diverse cellulaire processen reguleren de dynamiek en functie van BDNF. Op het neuronale oppervlak bindt BDNF de tropomyosinereceptor kinase B (TrkB) en/of de p75-neurotroffinereceptor (p75). BDNF-TrkB- en BDNF-p75-complexen worden geïndocyeerd en gesorteerd in verschillende endocytische organellen5,6,7,8. Een correcte intracellulaire handel in het BDNF/TrkB-complex is vereist voor een goede BDNF-signalering in verschillende neuronale circuits9,10,11. Om deze reden is een diepgaand begrip van de bdnf-handelsdynamiek en de veranderingen ervan in pathofysiologische processen essentieel om BDNF-signalering in gezondheid en ziekte te begrijpen. De ontwikkeling van nieuwe en specifieke moleculaire instrumenten om dit proces te volgen zal helpen om dit gebied vooruit te helpen en een beter inzicht in de betrokken regelgevingsmechanismen mogelijk te maken.
Er zijn verschillende instrumenten beschikbaar voor de studie van BDNF handel in neuronen. Een veelgebruikte methode omvat de transfectie van recombinant BDNF gelabeld met fluorescerende moleculen zoals groene fluorescerende eiwitten (GFP) of de monomerische fluorescerende roodverschuiving variant van GFP mCherry12,13. Echter, een belangrijke tekortkoming van BDNF overexpressie is dat het elimineert de mogelijkheid van het leveren van bekende concentraties van deze neurotrofine. Ook kan het resulteren in cellulaire toxiciteit, verduistering van de interpretatie van de resultaten14. Een alternatieve strategie is de transfectie van een epitoop-tagged TrkB, zoals Flag-TrkB. Deze methodologie maakt het mogelijk de studie van TrkB internalisatie dynamiek15, maar het gaat ook om transfectie, die kan resulteren in veranderde TrkB functie en cellulaire toxiciteit. Om deze methodologische hindernissen te overwinnen, werden recombinant varianten van NGF en BDNF met een Avi-sequentie (BDNFAvi), die mono-biotinylated kunnen worden door het biotine-ligase enzym BirA, ontwikkeld16,17. Biotinylated recombinant BDNF kan worden gekoppeld aan verschillende streptavidin-gebonden tools, waaronder fluoroforen, kralen, paramagnetische nanodeeltjes onder andere voor detectie. In termen van live-cel beeldvorming, quantum dots (QD) zijn vaak gebruikt fluoroforen, omdat ze wenselijke kenmerken voor single-particle tracking, zoals verhoogde helderheid en weerstand tegen fotobleaching in vergelijking met kleine molecuulfluoroforen18.
De productie van mono-biotinylated BDNF (mbtBDNF) met behulp van BDNFAvi is bereikt door co-transfectie van plasmiden die de expressie van BDNFAvi en BirA aansturen, gevolgd door de zuivering van het recombinant eiwit door affiniteit chromatografie met een opbrengst van 1-2 μg BDNF per 20 mL HEK293-geconditioneerde kweekmedia17. Hier stellen we een wijziging van dit protocol voor dat BDNFAvi-zuivering mogelijk maakt van 500 mL hek293-geconditioneerde media, die ernaar streeft om het herstel van eiwitten te maximaliseren in een chromatografie-kolom gebaseerd protocol voor het gemak van manipulatie. Het gebruikte transfectiemiddel polyethyleenimine (PEI) zorgt voor een kosteneffectieve methode zonder in te leveren op de opbrengst van de transfectie. De mono-biotinylation stap is aangepast aan een in vitro reactie om de complicaties in verband met co-transfecties te voorkomen en om homogene etikettering van BDNF te garanderen. De biologische activiteit van het mbtBDNF werd aangetoond door westerse vlekken- en fluorescentiemicroscopie-experimenten, waaronder activering van pCREB en live celbeeldvorming om retrograde axonale transport van BDNF in microfluidic kamers te bestuderen. Het gebruik van dit protocol maakt een geoptimaliseerde productie met een hoog rendement mogelijk van homogene mono-biotinylated en biologisch actieve BDNF.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit artikel wordt een geoptimaliseerde methodologie beschreven voor de productie en zuivering van mbtBDNF in een op affiniteit chromatografie gebaseerde procedure, gebaseerd op het werk van Sung en medewerkers17. De optimalisaties omvatten het gebruik van een kosteneffectieve transfectie reagens (PEI) met behoud van de efficiëntie van duurdere transfectie methoden zoals lipofectamine. Deze optimalisatie vertaalt zich in een aanzienlijke kostenbesparing in het protocol, waardoor schaalbaarheid …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen dankbaar financiële steun van Fondecyt (1171137) (FCB), het Basal Center of Excellence in Science and Technology (AFB 170005) (FCB), Millenium-Nucleus (P07/011-F) (FCB), de Wellcome Trust Senior Investigator Award (107116/Z/15/Z) (GS) en een Uk Dementia Research Institute Foundation award (GS). Dit werk werd ondersteund door de Unidad de Microscopía Avanzada UC (UMA UC).
Materials
| 2 way stopcock | BioRad | 7328102 | Chromatography apparatus component |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | BDNF elution buffer |
| Acrylamide/Bisacrylamide | BioRad | 1610154 | SDS-PAGE gel preparation |
| Amicon Ultra-15 10K | Millipore | UFC901024 | BDNF concentration |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A9164 | SDS-PAGE gel preparation |
| anti B-III-Tubulin antibody | Sigma | T8578 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti BDNF antibody | Alomone | AGP-021 | Western blot assays for BDNF quantification |
| anti BDNF antibody | Alomone | ANT-010 | Western blot assays for BDNF quantification |
| Anti ERK antibody | Cell Signaling | 9102 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pCREB antibody (S133) | Cell Signaling | 9198 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pERK antibody (T202, Y204) | Cell Signaling | 4370 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pTrkB antibody (Y515) | Abcam | ab109684 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| Antibiotic/Antimycotic | Gibco | 15240-062 | HEK293 maintenance |
| ATP | Sigma | A26209 | BDNF monobiotinylation buffer |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | Neuron maintenance |
| Bicine | Sigma | B3876 | BDNF monobiotinylation buffer |
| BirA-GST | BPS Bioscience | 70031 | Enzyme for BDNF AviTag monobiotinylation |
| Bovine Fetal Serum | HyClone | HC.SH30396.02 | HEK293 maintenance |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | BDNF buffer modification component, blocking buffer for western blot and immunofluorescence |
| D-Biotin | Sigma | B4639 | BDNF monobiotinylation buffer |
| Dithiothreitol | Invitrogen | 15508-013 | |
| DMEM High Glucose Medium | Gibco | 11965-092 | Neuron seeding |
| DMEM Medium | Gibco | 11995-081 | HEK293 maintenance |
| Econo Column Funnel | BioRad | 7310003 | Chromatography apparatus component |
| EDTA | Merck | 108418 | |
| EZ-ECL Kit | Biological Industries | 1633664 | Protein detection by western blotting |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Neuron and HEK293 maintenance |
| Glycerol | Merck | 104094 | BDNF elution buffer, lysis buffer for western blot assays |
| Hettich Rotina 46R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for clearing the medium of debris |
| Hettich Universal 32R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for protein concentrator centrifugation |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Neuron seeding |
| ImageQuant LAS 500 | GE Healthcare Life Sciences | 29005063 | Western blot image acquisition |
| Imidazole | Sigma | I55513 | BDNF buffer modification component |
| KCl | Winkler | BM-1370 | PBS component |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | PBS component |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | Cover coating for compartmentalized neurons |
| Luer Tubing Adaptor | BioRad | 7323245 | Chromatography apparatus component |
| Luminata™ Forte Western HRP Substrate | Millipore | WBLUF0100 | Protein detection by western blotting |
| Mg(CH3COO)2 | Merck | 105819 | BDNF monobiotinylation buffer |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | Mounting reagent for immunofluorescence assays |
| MyOne C1 Streptavidin Magnetic Beads | Invitrogen | 65001 | Biotinylation verification |
| Na2HPO4 | Merck | 106586 | BDNF buffer modification component |
| NaCl | Winkler | BM-1630 | PBS component, BDNF buffer modification component |
| NaH2PO4 | Merck | 106346 | BDNF buffer modification component |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | Neuron maintenance |
| Ni-NTA Agarose Beads | Qiagen | 30210 | BDNF AviTag purification |
| Nikon Ti2-E | Nikon | Microscope for fluorescence imaging | |
| Nitrocellulose Membrane | BioRad | 1620115 | Protein transfer for western blotting |
| ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | Camera for epifluorescence imaging |
| P8340 Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | BDNF buffer modification component |
| Paraformaldehyde | Merck | 104005 | Fixative for immunofluorescence assays |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Neuron maintenance |
| Poli-D-Lysine | Corning | DLW354210 | Cover coating for compartmentalized neurons |
| Poli-L-Lysine | Millipore | P2363 | Cover coating for non-compartmentalized neurons |
| Poly-Prep Chromatography Column | BioRad | 7311550 | Chromatography apparatus component |
| Polyethyleneimine 25K | Polysciences Inc. | PLY-0296 | HEK293 transfection |
| Quantum Dots 655 streptavidin conjugate | Invitrogen | Q10121MP | Monobiotinylated BDNF AviTag label for live and fixed cell experiments |
| Saponin | Sigma | S4521 | Detergent for immunofluorescence assays |
| Sucrose | Merck | 107687 | |
| Syldgard 184 silicone elastomer base | Poirot | 4019862 | Microfluidic chamber preparation |
| TEMED | Sigma | T9281 | SDS-PAGE gel preparation |
| Tris | Winkler | BM-2000 | Lysis buffer component |
| Triton X100 | Merck | 108603 | Cell permeabilization in immunofluorescence and western blot assays |
| Trypsin-EDTA 0.5% | Gibco | 15400-054 | HEK293 passaging |
References
- Huang, E., Reichardt, L. Neurotrophins: Roles in Neuronal Development and Function. Annual Review of Neuroscience. 24, 677-736 (2001).
- Skaper, S. D. The neurotrophin family of neurotrophic factors: an overview. Methods in Mollecular Biology. 846, 1-12 (2012).
- Gonzalez, A., Moya-Alvarado, G., Gonzalez-Billault, C., Bronfman, F. C. Cellular and molecular mechanism regulating neuronal growth by brain-derived neurotrophic factor. Cytoskeleton. 73 (10), 612-628 (2016).
- Cunha, C., Brambilla, R., Thomas, K. A simple role for BDNF in learning and memory. Frontiers in Mollecular Neuroscience. 3, 1 (2010).
- Bronfman, F. C., Lazo, O. M., Flores, C., Escudero, C. A., Lewin, G., Carter, B. Spatiotemporal intracelular dynamics of neurotrophin and its receptors. Implications for neurotrophin signaling and neuronal function. Neurotrophic Factor. Handbook of Experimental Pharmacology. 220, (2014).
- Ascano, M., Bodmer, D., Kuruvilla, R. Endocytic trafficking of neurotrophins in neural development. Trends in Cell Biology. 22 (5), 266-273 (2012).
- Deinhardt, K., Salinas, S., Verastegui, C., Watson, R., Worth, D., Hanrahan, S., Bucci, C., Schiavo, G. Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway. Neuron. 52 (2), 293 (2006).
- Escudero, C. A., et al. c-Jun N-terminal kinase (JNK)-dependent internalization and Rab5-dependent endocytic sorting medaited long-distance retrograde neuronal death induced by axonal BDNF-p75 signaling. Scientific Reports. 9, 6070 (2019).
- Vrabec, J. P., Levin, L. A. The neurobiology of cell death in glaucoma. Eye. 21, 11-14 (2007).
- Liot, G., Zala, D., Pla, P., Mottet, G., Piel, M., Saudou, F. Mutant huntingtin alters retrograde transport of TrkB receptors in striatal dendrites. Journal of Neuroscience. 33 (15), 6298-6309 (2013).
- Zhou, B., Cai, Q., Xie, Y., Sheng, Z. H. Snapin recruits dynein to BDNF-TrkB signaling endosomes for retrograde axonal transport and is essential for dendrite growth of cortical neurons. Cell Reports. 2 (1), 42-51 (2012).
- Haubensak, W., Narz, F., Heumann, R., Lessmann, V. BDNF-GFP containing secretory granules are localized in the vicinity of synaptic junctions of cultured cortical neurons. Journal of Cell Science. 111 (11), 1483-1493 (1998).
- Adachi, N., et al. Glucocorticoid affects dendritic transport of BDNF-containing vesicles. Scientific Reports. 5, 12684 (2015).
- Biocompare: The Buyer’s Guide for Life Scientists. Mirus Bio. Cellular Toxicity Caused by Transfection: Why is it important Available from: https://www.biocompare.com/Bench-Tips/121111-Cellular-Toxicity-Caused-by-Transfection-Why-is-it-important/ (2012)
- Zhao, L., et al. Mechanism underlying activity-dependent insertion of TrkB into the neuronal surface. Journal of Cell Science. 122 (17), 3123-3136 (2009).
- Zhao, X., Zhou, Y., Weissmiller, A., Pearn, M., Mobley, W., Wu, C. Real-time imaging of axonal transport of quantum dot-labeled BDNF in primary neurons. Journal of Visualized Experiments. 91, 51899 (2014).
- Sung, K., Maloney, M., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of Neuroscience Methods. 200 (2), 121-128 (2011).
- Deerinck, T. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
- Unsain, N., Nuñez, N., Anastasia, A., Mascó, D. H. Status epilepticus induces a TrkB to p75 neurotrophin receptor switch and increases brain-derived neurotrophic factor interaction with p75 neurotrophon receptor: an initial event in neuronal injury induction. 神经科学. 154 (3), 978-993 (2008).
- Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. Methods Mol Biol. 32, 5-8 (1994).
- Moya-Alvarado, G., Gonzalez, A., Stuardo, N., Bronfman, F. C. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) regulates Rab5-positive early endosomes in hippocampal neurons to induce dendritic branching. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 493 (2018).
- Sasi, M., Vignoli, B., Canossa, M., Blum, R. Neurobiology of local and intercellular BDNF signaling. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 469 (5), 593-610 (2017).
- . The Rab5-Rab11 endosomal pathway is required for BDNF-induced CREB transcriptional regulation in neurons Available from: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/844720v1 (2019)
- Mowla, , et al. Biosynthesis and post-translational processing of the precursor to brain-derived neurotrophic factor. Journal of Biological Chemistry. 276 (16), 12660-12666 (2001).
- Longo, P., Kavran, J., Kim, M. S., Leahy, D. Transient Mammalian Cell Transfection with Polyethyleneimine (PEI). Methods in Enzymology. 529, 227-240 (2013).
- Raymond, C., Tom, R., Perret, S., Moussouami, P., L’Abbé, D., St-Laurent, G., Durocher, Y. A simplified polyethyleneimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications. Methods. 55 (1), 44-51 (2011).
- Dalton, A., Barton, W. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Science. 23 (5), 517-525 (2014).
- Hunter, M., Yuan, P., Vavilala, D., Fox, M. Optimization of protein expression in mammalian cells. Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 77 (2019).
- Stepanenko, A. A., Heng, H. H. Transient and stable vector transfection: Pitfalls, off-target effects, artifacts. Mutation Research. 773, 91-103 (2017).
- Guerzoni, L. P., Nicolas, V., Angelova, A. In vitro modulation of TrkB receptor signaling upon sequential delivery of curcumin-DHA loaded carriers towards promoting neuronal survival. Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).
- Angelova, A., Angelov, B. Dual and multi-drug delivery nanoparticles towards neuronal survival and synaptic repair. Neural Regeneration Research. 12 (6), 886-889 (2017).
