Methylation Specific Multiplex Droplet PCR usando dispositivo gerador de gotícula de polímero para diagnósticos hematológicos
Summary
Marcadores epigenéticos são usados para subtipagem de glóbulos brancos (WBC) através da quantificação dos padrões de metilação de DNA. Este protocolo apresenta um método de reação em cadeia de polimerase de gotícula multiplex (mdPCR) usando um dispositivo microfluido baseado em elastômero termoplástico (TPE) para geração de gotículas permitindo quantificação de alvo específica e multiplex específica da contagem diferencial WBC.
Abstract
Um fluxo de trabalho de gotícula multiplexada PCR (mdPCR) e um protocolo detalhado para determinar a contagem diferencial de células brancas baseadas em epigenética (WBC) são descritos, juntamente com um dispositivo de geração de gotículas microfluida (TPE) termoplástico. Marcadores epigenéticos são usados para subtipagem WBC que é de importante valor prognóstico em diferentes doenças. Isso é conseguido através da quantificação dos padrões de metilação de DNA de regiões específicas ricas em CG no genoma (CpG loci). Neste artigo, o DNA tratado por bisulfita de células mononucleares de sangue periféricos (PBMCs) é encapsulado em gotículas com reagentes mdPCR, incluindo primers e sondas fluorescentes de hidrólise específicas para loci de CpG que se correlacionam com sub-populações WBC. A abordagem multiplex permite o interrogatório de muitos locis de CpG sem a necessidade de reações mdPCR separadas, permitindo uma determinação paramétrica mais precisa das subsépas WBC usando análise epigenética de locais de metilação. Essa quantificação precisa pode ser estendida a diferentes aplicações e destaca os benefícios para o diagnóstico clínico e prognóstico subsequente.
Introduction
A análise da composição dos glóbulos brancos (WBCs) está entre os exames laboratoriais mais solicitados em diagnósticos hematológicos. A contagem diferencial de leucócitos serve como um indicador para um espectro de doenças, incluindo infecção, inflamação, anemia e leucemia, e está sendo investigada como um biomarcador prognóstico precoce para várias outras condições também. O padrão-ouro na subtipagem WBC envolve a imunostenção e/ou citometria de fluxo, ambos que requerem anticorpos fluorescentes caros e propensos à instabilidade e são muitas vezes altamente dependentes da proficiência do operador na preparação da amostra. Além disso, este método é aplicável apenas a amostras de sangue fresco, de modo que as amostras não podem ser congeladas para embarque ou análise posterior.
Os marcadores epigenéticos surgiram recentemente como poderosas ferramentas analíticas para o estudo de variações fenotípicas. Posteriormente, as populações de leucócitos humanos têm mostrado ter padrões de metilação de DNA de linhagem celular que permitem a caracterização precisa dos subconjuntos WBC. A subtipagem baseada em marcadores epigenéticos fornece uma alternativa promissora que não depende de coleta de amostras de sangue fresco ou anticorpos caros e pode ser explorada como biomarcadora para o aparecimento da doença e suscetibilidade1,,2,3,,4,5.
Estudos em todo o genoma têm sido realizados para mapeamento extensivo de regiões ricas em CG específicas metiladas no genoma (ilhas CpG) em subtipos de leucócitos para identificar marcadores epigenéticos candidatos específicos para subtipos de leucócitos. Os protocolos PCR foram desenvolvidos por essa razão para regiões genéticas metiladas, por exemplo, CD3Z e FOXP3, correspondentes a CD3+ T-Cells e CD4+ CD25+ Células T Regulatórias (T-Regs), respectivamente. Wiencke et al. demonstraram a utilidade do PCR de gotícula duplex para subtipagem epigenética de Células T, produzindo resultados altamente correlacionados com a análise de classificação celular ativada de fluxo (FACS)6. Este método de análise genética quantitativa baseia-se na particionamento das moléculas de ácido nucleico modelo e reagentes PCR em milhares de gotículas discretas, volumosicamente definidas, sub-nanoliteras contendo zero, uma ou mais cópias de ácido nucleico alvo, utilizando emulsões de água em óleo habilitadas por microfluidos7,,8. A amplificação do PCR é realizada dentro de cada gotícula individual e a intensidade de fluorescência de ponto final de cada gotícula é medida, permitindo quantificação absoluta dos alvos presentes na amostra. O CDR gotícula foi estabelecido para ser mais preciso, preciso e tecnicamente mais simples do que o qPCR padrão, tornando-o um método mais favorável baseado em metilação de DNA para avaliação clínica de Células T. Embora uma metodologia de subtipagem rapidamente emergente, a análise epigenética multiplexada para sondar várias regiões de CpG metiladas simultaneamente está em falta. Isso é necessário para contagem diferencial de leucócito de rotina.
Aqui, um dispositivo microfluido de gotícula termoplástica (TPE) é apresentado e empregado para pcr de gotícula multiplex específica de metilação (mdPCR). A tecnologia tem sido usada para delinear subtipos específicos de leucócitos, CD3+ T-Cells e CD4+ CD25+ T-Regs, baseados em padrões de metilação de DNA de linhagem celular, ou seja, variação epigenética das regiões CD3Z e FOXP3 CpG, respectivamente. Um protocolo detalhado para extração de DNA, conversão de bissulfito e mdPCR é descrito em conjunto com um método de fabricação para um dispositivo de geração de gotículas TPE. Os resultados representativos do método são comparados aos da coloração da imunofluorescência, destacando a utilidade da abordagem proposta.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo experimental apresentado e os métodos permitem o mdPCR interno usando um gerador de gotícula TPE fabricado, um cicloviário térmico e microscópio de fluorescência. O dispositivo fabricado usando tpe macio para ligação TPE oferece propriedades de superfície hidrofóbica que são uniformes em todas as paredes do canal, de tal forma que o dispositivo final não requer qualquer tratamento de superfície para uso subsequente como gerador de gotículas. Este material tem sido rotineiramente empregado em pla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores reconhecem o apoio financeiro do Conselho Nacional de Pesquisa do Canadá.
Materials
| Bio-Rad, Mississauga, ON | TFI0201 | PCR tube | |
| RAN Biotechnologies, Beverly, MA | 008-FluoroSurfactant | Fluoro-surfactant | |
| Silicon Quest International, Santa Clara, CA | |||
| Oxford Instruments, Abingdon, UK | EMCCD camera | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | MA5-16728 | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 22-8425-71 | ||
| CellProfiler | Used for fluorescence image analysis | ||
| Nikon, Japan | 10x objective | ||
| American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | PCS-800-011 | ||
| Ramé-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ) | p/n 200-U1 | ||
| Fisher, Canada | |||
| Vitrocom, NJ, USA | 5015 and 5010 | Borosilicate capilary tube | |
| (http://definetherain.org.uk/) | |||
| Hamamatsu, Japan | LC-L1V5 | DEL UV light source | |
| Dolomite | 3200063 | Disposable fluidic tubing | |
| Dolomite | 3200302 | Disposable fluidic tubing | |
| IDT, Coralville, IA | |||
| Nikon, Melville, NY | Upright light microscope | ||
| Cytec Industries, Woodland Park, NJ | |||
| EV Group, Schärding, Austria | |||
| Zymo Research, Irvine, CA | D5030 | ||
| Photron, San Diego, CA | |||
| IDT, Coralville, IA | |||
| Gersteltec, Pully, Switzerland | SU-8 photoresist | ||
| Fineline Imaging, Colorado Springs, CO | |||
| Qiagen, Hilden, Germany | 203603 | ||
| Image J | Used to assess droplet diameter | ||
| Anachemia, Montreal, QC | |||
| Excelitas, MA, USA | Broad-spectrum LED fluorescent lamp | ||
| Galenvs Sciences Inc., Montreal, QC | DE1010 | ||
| Hexpol TPE, Åmål, Sweden | Thermoplastic elastomer (TPE) | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 13-400-518 | ||
| Nikon, Japan | Used for image acquisition | ||
| 3M, St Paul, MN | Carrier Oil | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | R37605 | Blue fluorescent live cell stain (DAPI) | |
| IDEX Health & Science, Oak Harbor, WA | P-881 | PEEK fittings | |
| Sigma-Aldrich, Oakville, ON | 806552 | ||
| Dow Corning, Midland, MI | |||
| ThinkyUSA, CA, USA | ARV 310 | ||
| Ihc world, Maryland, USA | IW-125-0 | ||
| Zinsser NA, Northridge, CA | 2607808 | ||
| Cetoni GmbH, Korbussen, Germany | |||
| Sigma-Aldrich, Oakville, ON | 484431 | ||
| Bio-Rad, Mississauga, ON | 1861096 | ||
| Hitachi High-Technologies, Mississauga, ON | |||
| Nikon, Melville, NY | Inverted microscope | ||
| Nikon, Japan | |||
| Loctite | AA 352 |
References
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